比较蛋白质组学研究大鼠感觉与运动神经差异表达蛋白

摘要

目的：采用相对和绝对定量的等量异位标签(iTRAQ)偶联在线二维液相色谱串联质谱(2D LC-MS/MS)的定量蛋白质组学技术，建立大鼠感觉与运动神经的全蛋白质组表达谱，通过定量分析得到差异表达蛋白；采用UniProt蛋白数据库和PubMed等生物信息学工具对全蛋白表达谱和差异表达蛋白根据生物学功能进行分类。从蛋白水平分析感觉与运动神经功能差异的物质基础，并为进一步深入探讨感觉与运动神经特异性再生的机制提供科学依据。
　　方法：
　　1、根据解剖学结构分离感觉与运动神经，取材备用；提取蛋白样品，采用Bradford法测定总蛋白浓度。进行SDS-PAGE电泳，检测蛋白样品的质量。
　　2、蛋白样品经过丙酮沉淀，酶解，iTRAQ标记后，使用AnalystTM1.1软件控制Nano-HPLC system和hybrid Q-TOF mass spectrometer(QSTAR XL)并采集数据。
　　3、通过ProteinPilotTM4.0软件鉴定并定量多肽和蛋白质。
　　4、蛋白质组学分析中获得的全蛋白表达谱和差异表达蛋白通过检索 Uniprot蛋白数据库和PubMed数据库，根据其生物学功能进行分类。
　　5、通过Western blot和qRT-PCR方法分别对感觉与运动神经差异表达蛋白及基因进行验证。
　　6、通过免疫组化染色对感觉与运动神经差异表达蛋白进行定位分析。
　　结果：
　　1、根据解剖学结构，成功获得感觉与运动神经。SDS-PAGE电泳的结果显示感觉与运动神经蛋白样品品质较佳。
　　2、经 ProteinPilotTM4.0软件分析，获得感觉与运动神经全蛋白质组表达谱。以蛋白置信度>95％或ProtScore>1.3为限，共鉴定了1472个非冗余蛋白，并根据生物学功能分类。
　　3、蛋白质组学检测的1472个非冗余蛋白以90%可信区间计算117/116（感觉神经/运动神经）的比值，比值≥2.0237的为感觉神经高表达蛋白；≤0.5010的为运动神经高表达蛋白。结果发现有100个显著差异表达蛋白，其中56个为感觉神经高表达、运动神经低表达蛋白，44个为运动神经高表达、感觉神经低表达蛋白。
　　4、56个感觉神经高表达蛋白根据生物学功能分类，其中40个可以分为以下10类，包括：细胞粘附蛋白、肌动蛋白结合蛋白、钙结合蛋白、信号转导蛋白、神经元可塑性调节蛋白、酶、脂代谢蛋白、DNA结合蛋白、SNAP复合体蛋白和ATP结合蛋白，其余16个归为杂类和未鉴定蛋白。
　　5、44个运动神经高表达蛋白根据生物学功能分类，其中35个可以分为以下12类，包括：细胞骨架蛋白、细胞外基质分子、氧化还原通路相关蛋白、神经营养因子、肌动蛋白结合蛋白、信号转导蛋白、转运蛋白、钙结合蛋白、酶、酶抑制剂、脂代谢蛋白和ATP结合蛋白，其余9个归为杂类和未鉴定蛋白。
　　6、通过qRT-PCR分别对100个差异表达蛋白中的20个感觉神经高表达蛋白与14个运动神经高表达蛋白进行验证，结果与蛋白质组学的检测一致。
　　7、 Western blot结果显示CALB2，CNPase和SNAP-25在感觉神经中高表达， CNTF，NFh，NES和VIM在运动神经中高表达，结果与蛋白质组学的检测一致。
　　8、免疫组化结果显示CNPase，NCAM1和L1与施万细胞的标记物S100共定位；CALB2和SNAP-25既与神经元标记物NF200共定位，也与施万细胞的标记物S100共定位。提示CNPase，NCAM1和L1的差异表达由施万细胞产生，而CALB2和SNAP-25的差异表达既由神经元，也由施万细胞产生。
　　结论：
　　1、通过iTRAQ偶联2D LC-MS/MS的定量蛋白质组学技术，在建立大鼠感觉与运动神经的全蛋白质组表达谱的基础上，通过定量分析得到100个差异表达蛋白，其中56个为感觉神经高表达、运动神经低表达蛋白，44个为运动神经高表达、感觉神经低表达蛋白。
　　2、采用生物信息学工具对所鉴定的差异表达蛋白进行功能分类，发现主要涉及细胞粘附蛋白、钙结合蛋白、脂代谢蛋白、神经元可塑性调节蛋白、SNAP复合体蛋白、DNA结合蛋白、细胞骨架蛋白、细胞外基质、氧化还原通路相关蛋白、神经营养因子、转运蛋白和酶抑制剂等。
　　3、免疫组化染色结果显示差异表达蛋白既有神经元表达的差异，也有施万细胞表达差异。

目录

封面

中文摘要

英文摘要

目录

前 言

材料与方法

1. 材料

2．方法

结 果

（一）感觉与运动神经分离取材

（二）感觉与运动神经蛋白质组学结果

（三）感觉与运动神经差异表达蛋白功能分类

（四）qRT-PCR对部分差异表达蛋白进行基因验证

（五）Western blot对差异表达蛋白进行验证

（六）免疫组织化学染色对部分差异表达蛋白进行定位分析

讨 论

结 论

参考文献

综 述

参考文献

英文缩略词表

附 录

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