DNA甲基化与慢性髓细胞白血病急变的相关性及慢性髓细胞白血病动物模型的建立

摘要

一、DNA甲基化与慢性髓细胞白血病急变的相关性
　　 目的：探讨慢性髓细胞白血病急变时的DNA甲基化程度，以及急变与DNA甲基化转移酶突变的关联性，并观察去甲基化药物（地西他滨）对K562细胞生长状态的影响，为进一步研究慢性髓细胞白血病急变期的甲基化状态提供体外研究依据。
　　 方法：1）、收集就诊于苏州大学附属第一医院的四对CML患者骨髓标本（即同-患者的慢性期及急变期标本），抽提基因组DNA，应用MspⅠ和HapⅡ双酶切检测其整体甲基化状态;此外，再收集初诊慢性髓细胞白血病慢性期（15例）及慢性髓细胞白血病急变期（13例）患者新鲜骨髓标本，抽提总mRNA，荧光实时定量PCR检测DNA甲基化转移酶表达水平，以缺铁性贫血（10例）患者骨髓标本为对照。2）、整理2003年至2010年就诊于苏州大学附属第一医院的慢性髓细胞白血病实验室资料，从中筛选出81例CML-BC患者骨髓冻存细胞和染色体悬液，抽提基因组DNA，行DNMT3A全外显子测序。3）、将地西他滨按2μmol/L浓度加至对数生长期K562细胞，0.4％台盼蓝染色后活细胞计数、软琼脂培养观察集落形成能力，流式细胞术测定细胞周期及细胞凋亡，并分别用QRT-PCR和Westernbloting检测地西他滨处理前后DNA甲基化转移酶(DNMT1，DNMT3A，DNMT3B)在mRNA水平和蛋白水平的变化，均以未予以地西他滨处理的K562细胞为对照。
　　 结果：1）、MspⅠ和HapⅡ双酶切提示CML-CP和CML-BC均存在处于高甲基化状态，但尚无明显差异;初治慢性髓细胞白血病慢性期与急变期相比，急变期DNA甲基化转移酶表达水平高于慢性期患者(P＜0.005)，此外，慢性期及急变慢性髓细胞白血病DNA甲基化转移酶水平均高于缺铁性贫血组患者(P＜0.05)。2)、所检测的81例慢性髓细胞白血病急变患者，其基因组DNA未见DNMT3A编码区外显子突变。3)、与未处理组相比，地西他滨处理后K562细胞的增殖能力下降，细胞生长抑制率明显增加，软琼脂培养集落形成能力下降，细胞周期测定其大多细胞被阻滞在G2/M期，细胞凋亡率明显增加，DNA甲基化转移酶(DNMT1，DNMT3A,DNMT3B)在mRNA和蛋白水平上不但无明显下降，相反，其表达水平均有不同程度的升高(P＜0.005)，有统计学差异。
　　 结论：1）、DNA高甲基化参与了慢性髓细胞白血病的发生及急性变过程，但是其机制与DNMT3A全外显子突变无相关性。2）、地西他滨对K562细胞的增殖、细胞周期及细胞凋亡均有影响，可抑制明显K562细胞的生长，促进凋亡的发生，但并非通过降低DNMTs的表达水平发挥作用，其作用机制尚需进一步研究。
　　 二、移植性慢性髓细胞白血病裸鼠模型建立的初步结果
　　 目的：慢性髓细胞白血病(Chronicmyeloidleukemia，CML)是一种起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，CML干细胞被认为是导致疾病发生、发展并最终急变的根源，目前尚缺乏稳定的动物模型证明CML干细胞的存在。本文旨在通过建立慢性髓细胞白血病裸鼠模型，探讨人慢性髓细胞白血病细胞在Babl/c裸小鼠体内的生物学行为，并使CML干细胞在裸鼠体内富集成为可能。
　　 方法：对4至6周龄的BALB/c裸鼠进行切脾(splenectomy)，环磷酰胺腹腔注射（cytoxanintraperitonealinjection）及全身亚致死剂量辐照（sublethalirradiation）等预处理(SCI)后，经尾静脉接种(5-8)×107个人慢性髓细胞白血病慢性期患者单个核细胞。对4至6周龄的BALB/c裸鼠进行全身致死剂量辐照(lethalirradiation)后，经尾静脉接种5×106同源裸鼠骨髓细胞+(5-8)×107个人慢性髓粒细胞白血病慢性期患者单个核细胞。应用RT-PCR、塑胶包埋病理切片以及流式细胞术等检测裸鼠各脏器及骨髓中人CML细胞浸润情况。
　　 结果：CML细胞能浸润至经SCI预处理的裸鼠骨髓体内，但目前成功率还很低，仅为通过Babl/c裸鼠建立人CML动物模型的一个开端。
　　 结论：人CML慢性期白血病细胞能在经SCI预处理的裸鼠体内形成白血病，为建立CML动物模型寻找到新的方向。