基因突变敏感性分子开关检测HIV-1耐药基因突变

摘要

目的：利用高保真聚合酶介导的突变敏感性分子开关，建立对HIV-1七个耐药突变位进行快速筛查的技术平台，采用单一PCR和多重PCR相结合，检测耐药基因相关突变的有无，为HIV耐药性评估提供依据，指导HIV患者合理用药。
　　方法：将包含HIV-1耐药突变的PCR产物克隆至pMD-19-T载体，通过含氨苄的LB平板筛选阳性克隆，挑选菌落进行培养并提取质粒DNA。对质粒DNA进行PCR扩增初步确定阳性克隆，并通过测序分析确证，获得包含HIV-1耐药突变相对应的野生型质粒模板。突变型模板直接由公司合成，包含目前已知的HIV-1耐药突变二十七个，本研究选择七个高频突变位点建立快速检测体系。所选七个突变位点分别是M41L(ATG/CTG)、K65R(AAA/AGA)、T69N(ACT/AAT)、M184V(ATG/GTG)、V75I(GTA/ATA)、V82A(GTC/GCC)和L90M(TTG/ATG)。实验以这七个突变位点为检测靶点，分别设计3’末端与野生型基因位点或突变基因位点配对的引物，硫化磷酸修饰3’末端并偶联高保真DNA聚合酶构成的基因突变敏感性分子开关。首先在不同体系分别对含有相应七个突变的突变质粒模板及野生型质粒模板进行引物延伸反应，并通过凝胶成像系统对其进行分析；然后在同一体系同时对含有相应七个突变的突变质粒模板及野生型质粒模板进行引物延伸反应，并通过凝胶成像系统对其进行分析；最后结合荧光定量分析进行检测。
　　结果：在不同反应体系分别对七个热点突变进行检测。在一定的反应条件及反应体系下，特异性野生检测引物与野生模板配对得以延伸；而与突变模板不配对则不能延伸。当特异性突变检测引物与突变模板配对，引物得以延伸；而与野生模板不配对则不能延伸。结果显示，使用野生型质粒模板，该方法仅能使野生型等位基因相关引物得以延伸，而突变等位基因位点特异性引物不能被延伸。反之，使用突变质粒模板，该方法仅能使突变型等位基因位点相关引物得以延伸，而野生型等位基因位点特异性引物不能被延伸。在同一反应体系同时对以上热点突变进行检测。同样，完全配对引物能被延伸，不完全配对引物不能被延伸。分子开关对上述七个位点的识别敏感性大部分可达到101~109拷贝，特异性分别为104~105拷贝，这一特定引物扩增特定模板的特异性在突变与野生序列之间的达到3个或3个以上对数级，能有效早期检测耐药突变。
　　结论：高保真酶介导的突变敏感性分子开关可用于已知基因突变的检测，除可用于检测某些遗传性突变外，还可以检测耐药基因突变。高保真DNA聚合酶偶联硫化修饰引物构成的突变敏感性分子开关能够快速筛查HIV-1七种突变，该技术在HIV-1耐药突变检测具有较大的潜在应用价值，可用来指导用药，尤其是早期监控耐药基因的突变。

目录

封面

中文摘要

英文摘要

目录

序 言

研究材料

一、主要仪器

二、主要试剂

三、主要溶液的配制

四、相关生物信息学软件及网站

研究方法

一、在线耐药突变分析与实验方案

二、实验方法

研究结果

讨 论

结 论

参考文献

攻读学位期间发表的论文、科研成果

综 述

英文缩略语索引

主要计算公式

致谢