新生大鼠高氧性肺损伤肺组织中AQP1、Na+-K+-ATPaseα1、NKCC1的蛋白和mRNA表达及沐舒坦的干预作用

摘要

目的：通过建立新生大鼠急性高氧性肺损伤模型及使用沐舒坦干预并与正常新生大鼠对比：
　　1.观察各组实验动物的一般情况、肺组织的病理学改变；
　　2.研究各实验组之间肺组织中水通道蛋白-1（AQP1）、钠钾ATP酶α1亚基(Na+-K+-ATPaseα1)、钠钾氯共同转运蛋白-1（NKCC1）的表达变化，以探讨AQP1、Na+-K+-ATPaseα1、NKCC1在急性高氧性肺损伤发病机制中的作用；
　　3.探讨沐舒坦对急性高氧性肺损伤是否有保护作用及是否对AQP1、Na+-K+-ATPaseα1、NKCC1的表达有调节作用，为临床防治新生儿高氧性肺损伤提供理论依据。
　　方法：将120只出生满48小时的新生SD大鼠（雌雄不限）随机分为三组：
　　I组：空气对照组；
　　II组：高氧组（高氧+生理盐水）；
　　III组：沐舒坦组（高氧+沐舒坦）。
　　I组新生大鼠置于常压空气中饲养。II组、III组新生大鼠置于氧浓度维持在95%以上的氧箱中饲养。III组于实验第一天起每日早晚腹腔注射沐舒坦(75mg/kg)各一次。Ⅰ组与II组于实验第一天起每日早晚腹腔注射等量生理盐水各一次。
　　每组按实验时间点分为1天、3天、7天三个亚组，每组于各实验时间点分别随机取实验鼠十二只，处死取材检测以下指标：
　　（1）肺泡灌洗液中总蛋白含量；
　　（2）取左肺称取其湿、干重，计算肺湿/干重比；
　　（3）肺组织病理学观察：取右上肺行病理切片后观察肺组织病理改变；
　　（4）肺组织AQP1，Na+-K+-ATPaseα1，NKCC1蛋白及mRNA含量测定：取部分肺组织匀浆提取蛋白通过western blotting方法分别测定其蛋白含量；另取部分肺组织提取RNA，通过RT-PCR方法分别测定其mRNA含量。
　　结果：
　　1.各组实验动物一般情况观察：空气组中的实验动物反应好，饮食佳，生长发育正常，无死亡。高氧组中的实验动物高氧暴露1天时反应好，肤色红润，离氧后无呼吸困难表现出现。高氧暴露三天后实验动物反应尚可，脱离氧气后呼吸频率稍加快。高氧暴露七天时实验动物精神萎靡，少吃少动，离氧后出现呼吸急促，唇色发绀，个别死亡。沐舒坦干预组的实验动物一般情况较高氧组有改善，无实验动物死亡。
　　2.肺组织病理学改变：空气组大鼠各时相肺组织未见病理改变，肺泡大小均一、肺泡腔内无液体渗出及细胞浸润。高氧组实验动物于高氧暴露1天时，肺泡结构完整，肺泡内可见少许红细胞，无明显渗出；3天后可见血管充血、肺间质水肿，肺泡内红细胞、炎症细胞浸润；7天时则出现肺组织水肿，结构紊乱，肺泡内出血、液体渗出、炎症细胞浸润明显加重。沐舒坦组的肺组织病理改变，肺泡腔内液体渗出，红细胞、炎性细胞浸润较高氧组明显减轻。
　　3.肺组织湿/干重比（W/D）：实验1天时，各组实验动物的肺组织W/D无明显差异（P＞0.05）。实验3天、7天时，高氧组实验动物的肺组织W/D较空气对照组有升高，沐舒坦组实验动物的肺组织W/D较高氧组有降低（P＜0.01）。
　　4.支气管肺泡灌洗液（BLAF）中总蛋白（TP）含量测定：实验1天时，三组实验动物BLAF中TP含量差异不明显，无统计学意义（P＞0.05）。而实验3天及7天时，高氧组实验动物的BLAF中TP含量明显高于空气对照组(P＜0.01)，而沐舒坦组的BLAF中TP含量则明显低于高氧组(P＜0.01)。
　　5.肺组织中AQP1，Na+-K+-ATPaseα1，NKCC1蛋白表达水平的变化：
　　（1）各组实验动物肺组织中的AQP1的蛋白表达水平在实验第1天无显著差异（P＞0.05）。实验第3天及第7天时，高氧组AQP1的蛋白表达水平较空气组有明显下降（P＜0.01）。沐舒坦干预组肺组织中的AQP1的蛋白表达明显高于高氧组，其差异有统计学意义（P＜0.01）。
　　（2）高氧组的Na+-K+-ATPaseα1的蛋白表达水平在实验第1天即低于空气对照组（P＜0.05），且于实验第3天、7天下降更明显（P＜0.01）。而沐舒坦组的Na+-K+-ATPaseα1蛋白表达水平在实验第3天、7天较高氧组有升高（P＜0.05）。
　　（3）三组实验动物肺组织中的NKCC1的蛋白表达水平在实验第1天时无统计学差异（P＞0.05）。实验3天时，高氧组的NKCC1蛋白表达水平较空气组有降低，而沐舒坦干预组的NKCC1蛋白表达水平则较高氧组有升高（P＜0.05）。实验第7天时，高氧组中的 NKCC1蛋白表达水平明显低于空气对照组，沐舒坦组的NKCC1蛋白表达水平明显高于高氧组（P＜0.01）。
　　6.肺组织中AQP1，Na+-K+-ATPaseα1，NKCC1的mRNA表达水平的变化：在本实验中，通过RT-PCR方法检测显示：
　　（1）高氧组肺组织中的AQP1的mRNA表达水平在实验第1天高于空气组，而在实验第3天、7天时其AQP1的mRNA表达水平明显低于空气对照组（P＜0.01）。沐舒坦干预组的AQP1的mRNA表达水平则于实验第3天、7天高于高氧组（P＜0.05）。
　　（2）空气组与高氧组肺组织中的Na+-K+-ATPaseα1和NKCC1的mRNA表达水平在实验第1天及第3天均无显著差异（P＞0.05），在实验第7天，高氧组的肺组织中Na+-K+-ATPaseα1及NKCC1的mRNA表达水平较空气对照组的相应mRNA表达有升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。而沐舒坦干预后，Na+-K+-ATPaseα1及NKCC1的mRNA表达水平与高氧组比较在各时间点均无明显差异（P＞0.05）。
　　结论：
　　1．暴露于高浓度氧气中一定时间可导致新生大鼠发生急性肺损伤，病理表现为肺组织水肿，肺组织结构紊乱，肺泡内出血、炎症细胞浸润明显。
　　2.急性高氧性肺损伤的实验动物肺组织中的AQP1、Na+-K+-ATPaseα1、NKCC1的蛋白表达水平及AQP1的mRNA的表达水平较正常空气组的肺组织的相应蛋白及mRNA的表达水平明显下降，且与肺水肿的程度相一致，提示AQP1、Na+-K+-ATPaseα1、NKCC1的蛋白表达水平及AQP1的mRNA的表达水平的变化在急性高氧性肺损伤的肺水肿的形成中起着重要作用。
　　3.沐舒坦可通过上调AQP1、Na+-K+-ATPaseα1、NKCC1的蛋白表达水平及AQP1的mRNA表达水平，改善肺水肿，从而对高氧性肺损伤起到一定保护作用。但是沐舒坦不能相应的上调Na+-K+-ATPaseα1、NKCC1的mRNA表达水平，其具体调节机制还不明确。

目录

封面

中文摘要

英文摘要

目录

引言

材料与方法

一、实验试剂及仪器

二、实验步骤和方法：

结果

一、实验动物一般情况

二、肺组织病理学改变

三、肺组织湿/干重比（ W/D）

四、支气管肺泡灌洗液（BLAF）中总蛋白含量测定

讨论

一、新生大鼠急性高氧性肺损伤

二、水通道蛋白（AQP1）、钠钾ATP酶（Na+-K+-ATPase）、钠钾氯共同转运蛋白（NKCC）的结构及在肺组织中的功能与调节

三、水通道蛋白-1（AQP1）、钠钾ATP酶α1亚基（Na+-K+-ATPaseα1）、钠钾氯共同转运蛋白-1（NKCC1）在急性高氧性肺损伤模型中的表达

四、沐舒坦对急性高氧性肺损伤模型中肺组织的保护作用

结论

参考文献

附录

综 述：肺泡上皮细胞的液体主动转运系统

一、肺泡液体的分泌与吸收机制

二、肺泡上皮细胞液体主动转运系统主要通道的结构及功能

三、肺泡上皮细胞液体主动转运系统的调节

参考文献

英汉双解缩略词表

攻读硕士学位期间发表的论文

致谢