大鼠骨髓间充质干细胞对心肌细胞电生理特征的影响

摘要

目的：骨髓间充质干细胞移植治疗心脏疾病可以提高心脏功能，改善心室重构，但干细胞对心脏电重构有何作用，尤其对病理状态下的心肌细胞电生理特征有何影响，目前研究不多。本研究利用体外培养的新生大鼠心室肌细胞，并诱导为病理细胞模型，与骨髓间充质干细胞共培养后，通过检测心肌细胞电生理特征变化，来研究骨髓间充质干细胞对心脏电重构是否有改善作用。
　　方法：
　　1.分离SD乳鼠心肌细胞培养，并检测其电生理特征。
　　2.分离SD大鼠骨髓间充质干细胞，培养传代至第三代。
　　3.将SD乳鼠心肌细胞培养液中加入10-7mol/l血管紧张素Ⅱ培养24h，诱导其为肥大心肌细胞，并通过BCA法测定心肌细胞总蛋白浓度及测量心肌细胞膜电容来验证细胞已诱导为肥大心肌细胞。
　　4.将 SD乳鼠心肌细胞放入低氧培养箱（内含5% CO2，94%N2，1%O2混合气体）培养24h，取出后加入提前30分钟通入氧气饱和的含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液，放入常规CO2培养箱中继续培养，诱导为缺氧-复氧心肌细胞，并通过测定培养液中LDH活力来反映心肌细胞缺氧损伤的程度。
　　5.利用Transwell培养板将SD大鼠骨髓间充质干细胞与正常心肌细胞、肥大心肌细胞及缺氧-复氧心肌细胞进行非接触共培养，对照组为人胚肾293细胞（HEK-293）与各组心肌细胞共培养，心肌细胞在下层，干细胞或HEK-293在上层，接种比例为10:1，共培养72h。
　　6.应用全细胞膜片钳技术记录正常心肌细胞、肥大心肌细胞、缺氧-复氧心肌细胞及与干细胞或HEK-293细胞共培养的各组心肌细胞的动作电位（AP）及瞬时外向钾电流（ITO），测量动作电位时程恢复至90%的时间（APD90），绘制瞬时外向钾通道的电流-电压曲线（I-V曲线）。
　　7.提取心肌细胞总蛋白，采用Western Blot方法检测骨髓间充质干细胞对心肌细胞瞬时外向钾通道Kv4.2膜蛋白表达量的影响。
　　8.提取心肌细胞mRNA，采用实时定量PCR技术检测骨髓间充质干细胞对心肌细胞瞬时外向钾通道Kv4.2 mRNA表达量的影响。
　　结果：
　　1. SD乳鼠心肌细胞培养液中加入浓度为10-7mol/l血管紧张素Ⅱ培养24h可成功诱导为肥大心肌细胞。肥大心肌细胞总蛋白浓度高于空白对照组（分别为128.4±17.6mg/well，n=6；103.4±8.9mg/well，n=8；p＜0.05)。全细胞膜片钳技术测定肥大心肌细胞膜电容大于对照组（分别为36.39±16.13pF（n=28）；26.14±7.83pF（n=35），p＜0.05）
　　2. SD乳鼠心肌细胞放入低氧培养箱中培养24小时，后加入复氧培养液常规培养可诱导为缺氧-复氧心肌细胞，测定缺氧24h的细胞培养液中的LDH活力较对照组明显升高（分别为547.20±42.12（n=9）；287.45±26.10（n=12）p＜0.05）。
　　3.应用全细胞膜片钳技术，测定各组心肌细胞的APD90，正常心肌细胞APD90为124.52±15.56ms，n=16；BMSCs与正常心肌细胞共培养APD90为102.15±11.37ms，n=9；HEK-293与正常心肌细胞共培养 APD90为126.31±11.04ms，n=8；肥大心肌细胞APD90为265.74±65.88ms，n=15；BMSCs与肥大心肌细胞共培养APD90为182.63±29.12ms，n=13；HEK-293与肥大心肌细胞共培养APD90为254.53±59.12ms，n=7；缺氧-复氧心肌细胞APD90为201.74±35.88ms，n=12；BMSCs与缺氧-复氧心肌细胞共培养APD90为168.03±24.12ms，n=10；HEK-293与缺氧-复氧心肌细胞共培养APD90为212.17±19.06ms，n=8。BMSCs可缩短正常心肌细胞、肥大心肌细胞及缺氧-复氧心肌细胞的动作电位时程（p＜0.05）。HEK-293细胞对心肌细胞动作电位时程无影响（p＞0.05）。
　　4.瞬时外向钾电流（ITO）：BMSCs与正常心肌细胞共培养组的 ITO通道的平均电流密度值高于正常心肌细胞组和 HEK-293共培养组（p＜0.05）；BMSCs与肥大心肌细胞共培养组的ITO通道的平均电流密度值高于肥大心肌细胞组和HEK-293共培养组（p＜0.05）；BMSCs与缺氧-复氧心肌细胞共培养组的 ITO通道的平均电流密度值与缺氧-复氧心肌细胞组和HEK-293共培养组相比差异无统计学意义（p＞0.05）。
　　5. Western blot检测结果显示，BMSCs可上调正常心肌细胞、肥大心肌细胞膜表面瞬时外向钾离子通道Kv4.2蛋白的表达量（p＜0.05），对缺氧心肌细胞的影响无统计学意义（p＞0.05）。
　　6.实时定量 PCR检测结果显示，BMSCs可上调正常心肌细胞、肥大心肌细胞 Kv4.2 mRNA的表达量（p＜0.05），对缺氧心肌细胞的影响无统计学意义（p＞0.05）。
　　结论：
　　1.肥大心肌细胞及缺氧-复氧心肌细胞的瞬时外向钾离子通道电流密度降低，动作电位时程延长。
　　2.骨髓间充质干细胞可以上调正常心肌细胞和肥大心肌细胞的瞬时外向钾电流、缩短动作电位时程，缩短缺氧-复氧心肌细胞动作电位时程。骨髓间充质干细胞对心肌细胞电重构有改善作用。
　　3.分子生物学实验结果显示，骨髓间充质干细胞可上调正常心肌细胞与肥大心肌细胞瞬时外向钾离子通道Kv4.2膜蛋白及Kv4.2mRNA的表达量，骨髓间充质干细胞对缺氧-复氧心肌细胞的Kv4.2膜蛋白及Kv4.2mRNA表达量的影响无统计学差异。

目录

封面

中文摘要

英文摘要

目录

前 言

参考文献

第一部分 新生大鼠心肌细胞的分离培养及电生理特征

一、材料与方法

二、实验结果

三、讨论

参考文献

第二部分 骨髓间充质干细胞对肥大心肌细胞及缺氧-复氧心肌细胞电生理特征的影响

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

第三部分 骨髓间充质干细胞对心肌细胞瞬时外向钾离子通道影响的分子生物学研究

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

结 论

综述 干细胞的心肌细胞保护作用

参考文献

中英文缩写

攻读学位期间公开发表的文章

致谢