重组野蚕丝素含RGD肽段的制备与表征

摘要

丝素是由蚕合成与分泌的天然蛋白质，包括家蚕丝素和野蚕（柞蚕、天蚕、蓖麻蚕、栗蚕、樟蚕和大山蚕等）丝素。目前对丝素蛋白的研究主要集中在家蚕丝素蛋白方面，大量的研究表明家蚕丝素蛋白材料能支持多种细胞的粘附、增殖或分化，适合用作生物材料。而柞蚕丝素和天蚕丝素蛋白的氨基酸组成中分布着较多的促细胞黏附的RGD短肽（细胞特异性粘附识别信号）序列，用作细胞外基质材料，应能提供更良好的细胞作用界面。为了系统地研究野蚕丝素蛋白序列-结构-功能间的关系，尤其是揭示野蚕丝素蛋白中与细胞功能密切关联的序列结构，我们对天蚕（柞蚕）丝素蛋白序列特征进行梳理，从基因水平上进行分子设计、采用大肠杆菌系统表达各种设计的基序或基序组合来加以研究。本文主要完成了一段含RGD肽段的重组表达，主要包括以下工作：
　　1、设计了编码来自天蚕(柞蚕)丝素蛋白GSGAGGRGDGGYGSGSS即(-RGD-)1序列的基因AY1，采用基因重组技术克隆加倍至24倍的基因延伸片段AY24，通过琼脂糖凝胶电泳及DNA测序了验证构建的基因是正确的。
　　2、将AY1及各加倍基因插入pcDNA3.1B、pET-30a(+)及pGEX-KG三种系列的表达载体，分别在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达。采用琼脂糖凝胶电泳和DNA测序鉴定了各个表达载体构建的正确性。经筛选后确定pGEX-KG表达载体用来表达含RGD重组蛋白，通过SDS-PAGE电泳及Western blotting验证了重组蛋白在大肠杆菌中成功获得了表达。
　　3、探讨了pGEX-AY12和pGEX-AY24两种表达载体分别表达的两种融合蛋白GST-(-RGD-)12和GST-(-RGD-)24的最佳表达条件。采用亲和层析柱纯化得到了纯度很高的两种融合蛋白。通过SDS-PAGE电泳和Western blotting定性检测表明：转入pGEX-AY12的大肠杆菌在诱导剂IPTG浓度为0.5mmol/L下诱导6小时，融合蛋白GST-(-RGD-)12表达量达到最大值；转入pGEX-AY24的大肠杆菌在诱导剂IPTG浓度为1.0mmol/L，诱导6小时，融合蛋白GST-(-RGD-)24表达量达到最大值。进一步定量测定得：每升菌液可获得GST-(-RGD-)12融合蛋白45mg左右；每升菌液可获得GST-(-RGD-)24融合蛋白28mg左右。
　　4、采用Thrombin蛋白酶酶切融合蛋白GST-(-RGD-)12和 GST-(-RGD-)24获得目的肽段(-RGD-)12和(-RGD-)24。通过Zeta电位测量与双向电泳分析了目的肽段的等电点，测得目的肽段(-RGD-)12的等电点为8.5左右，目的肽段(-RGD-)24的等电点为8.0左右，且与理论值基本相符。通过氨基酸组成分析表明大肠杆菌正确地表达了融合蛋白GST-(-RGD-)12和GST-(-RGD-)24。通过圆二色光谱对目的肽段的二级结构进行了初步的探索,结果表明两种目的肽段的分子构想以α-螺旋结构为主。

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第一章 引 言

1.1野蚕丝素蛋白的组成与结构

1.2野蚕丝素蛋白的应用

1.3 RGD三肽序列的功能及应用

1.4重组丝蛋白的研究

1.5 本文的研究目的和主要内容

第二章 野蚕丝素含RGD肽段的克隆及表达载体的构建

2.1 引言

2.2 实验部分

2.3 结果与分析

2.4本章小结

第三章 野蚕丝素含RGD肽段的表达

3.1 引言

3.2 实验部分

3.3 结果与分析

3.4 本章小结

第四章 重组野蚕丝素含RGD肽段的表征

4.1 引言

4.2 实验部分

4.3 结果与分析

4.4 结论

第五章 全文结语

5.1 全文结论

5.2 创新点

5.3 本文的不足与今后计划

参考文献

附录

攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文

致谢