自噬参与巨核细胞成熟与前血小板释放的初步研究

摘要

巨核细胞是血小板的前体细胞，该细胞的成熟需要经过多次核内有丝分裂（Endomitosis）。核内有丝分裂是一种特殊的细胞分裂方式，巨核细胞通过DNA复制但不进行细胞分裂来增大细胞胞浆的体积及增加染色体数目。巨核细胞的成熟为前血小板形成及骨髓血窦中血小板的释放积累了丰富的物质基础如RNA，蛋白质，致密性颗粒等。自噬（Autophagy）是真核细胞通过溶酶体途径降解及回收细胞内长寿命蛋白质或细胞器的过程。自噬在维持造血干细胞的干性及造血微环境中起到重要的作用，并且有少数文献报道自噬的异常会干扰髓系祖细胞增殖及分化，然而自噬与巨核细胞发育的相关性尚不清楚。本实验在于探讨自噬作用与巨核细胞系细胞分化及血小板发育之间的关系。
　　我们选用了巨核系白血病细胞Dami进行体外培养。实验用自噬激活剂雷帕霉素刺激Dami细胞检测巨核系细胞分化的标志性蛋白CD41的变化；用PMA刺激Dami细胞体外模拟巨核细胞的核内有丝分裂，利用Western blot检测自噬相关蛋白及利用流式细胞仪的技术检测细胞的核型变化；最后利用自噬抑制剂Bafilomycin A1阻断自噬小体的形成并检测其对Dami细胞核内有丝分裂的影响。
　　结果表明：
　　(1)通过雷帕霉素刺激可以提高Dami细胞内的自噬水平，同时可以显著（P<0.001）促进CD41的表达，表明自噬水平的提高会促进巨核系细胞的分化；
　　(2)通过PMA刺激Dami细胞进行体外模拟巨核细胞的核内有丝分裂，发现核内有丝分裂伴随着二型自噬相关蛋白LC3的增加，表明细胞染色体的积累可能与自噬相关；
　　(3)自噬的抑制剂Bafilomycin A1能阻断自噬溶酶体的形成，造成二型LC3蛋白的积累，本实验发现Bafilomycin A1的加入可以阻止PMA刺激的Dami细胞的核内有丝分裂，同时伴随着细胞的凋亡；
　　(4)建立了原代巨核细胞体外培养和实时观察成熟巨核细胞释放前血小板和血小板的方法学；
　　(5)初步观察了成熟巨核细胞释放前血小板和血小板基本过程，并发现 LC3II表达于该过程的不同形态的细胞中。
　　综上所述，雷帕霉素引起的自噬能促进巨核细胞系Dami细胞的分化并且PMA刺激的Dami细胞的核内有丝分裂与自噬水平提高相关。原代巨核细胞分化为成熟巨核细胞、释放前血小板、以及血小板的生成过程均有自噬相关蛋白表达。为进一步探讨巨核细胞核内有丝分裂与自噬的关系，以及血小板发育的调控，提供了研究基础。

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序 言

材料与方法

1 材料

2 方法

结 果

1自噬对Dami细胞分化的影响:

2 PMA刺激Dami细胞发生核内有丝分裂并促进细胞的分化：

3 Dami细胞的核内有丝分裂与自噬的关系A

4 提前用BafA处理PMA刺激的Dami细胞的细胞凋亡检测

5 巨核细胞以及前血小板内的LC3蛋白的检测A

讨 论

结 论

综 述

攻读硕士学位期间发表的论文

参考文献

缩略词表（Abbreviation）

附 图

致谢