Sox9在大鼠骨关节炎软骨中的表达及Wnt/β-catenin信号通路干预对其的影响

摘要

目的：
　　探讨实验性大鼠骨关节炎模型的有效性；探讨软骨细胞内Sox9基因在骨关节炎（Osteoarthritis,OA）进程中表达的特点，以及受Wnt/β-catenin信号通路（经典Wnt信号转导通路）干预后的影响。
　　方法：
　　105只SD大鼠随机分为手术组（实验组）、阻断Wnt/β-catenin信号通路组（干预组）和假手术组（对照组），每组各35只。
　　（1）实验性大鼠骨关节炎（OA）造模，手术组（实验组）：前交叉韧带横断和内侧半月板切除；对照组：打开关节腔，不切断交叉韧带和切除半月板；干预组：造模术后第二天始行降钙素15 IU/kg隔日皮下注射,实验组和对照组注射等量的生理盐水。在造模1w、2w、4w、6w、8w、12w处死大鼠。膝关节标本肉眼大体观察，取股骨内侧髁软骨作为组织标本，HE染色、甲苯胺蓝染色。以 Mankin评分为标准，对OA的病程进行分期。
　　（2）取股骨内侧髁软骨标本。各个时间点的标本经处理后，液氮保存，酶联免疫吸附法（ELISA）检测Sox9、II型胶原、聚蛋白多糖（Aggrecan）的蛋白含量，实时荧光定量PCR检测Sox9、II型胶原、聚蛋白多糖（Aggrecan）基因表达的变化，分析OA早、中、晚期上述细胞因子的变化特点。通过降钙素（CT）阻断Wnt/β-catenin通路后Sox9上调对各组大鼠标本软骨合成因子的影响，分析阻断Wnt/β-catenin通路后Sox9的变化对骨关节炎软骨的作用。
　　结果：
　　（1）实验组：造模1w肉眼观察没有变化，组织切片HE染色见不规则裂隙，甲苯胺蓝染色深染；2w关节软骨失去光泽，色暗， HE染色软骨细胞数量轻度增生，甲苯胺蓝深染；4w见软骨破坏，细胞数量增多；6w软骨溃疡破坏明显，骨赘增生，软骨层变薄，细胞排列紊乱，甲苯胺蓝染色变浅；8w软骨缺损，骨赘增生明显，有软骨细胞坏死，甲苯胺蓝染色大部分层次明显变浅；12w可见软骨下骨外露，细胞数量明显减少，甲苯胺蓝失染。干预组：病理改变时期延后2w。对照组大体和组织切片接近正常。
　　（2）ELISA测定和Realtime PCR
　　Sox9:在实验组，Sox9含量在4w前上调，有差异（P<0.05）；在6-12w，仍表现为上调，但没有差异（p>0.05）。在干预组，4w以前，Sox9上调趋势明显（P<0.05）；在6-12w，其表达仍表现为上调，但没有差异（p>0.05）。
　　II型胶原和聚蛋白多糖（Aggrecan）：在实验组，该两种蛋白表达呈下调趋势，且差异显著（p<0.01）；在干预组，该两种蛋白表达呈上调趋势，有差异（p<0.05）。干预组和实验组相比，4w后呈上调趋势（p<0.05）、其表达量在4w后也显著增多（p<0.01）。
　　结论：
　　（1）通过本实验研究我们发现手术切断前交叉韧带及内侧半月板可以有效的制作大鼠骨关节炎模型。而且手术创伤小，所需时间短，能反映骨关节炎由轻到重的整个病变过程。
　　（2）OA病程中，Sox9的表达呈上调趋势，说明软骨细胞一直在对抗自身的降解过程。II型胶原和聚蛋白多糖（Aggrecan）的表达是下调趋势，显示软骨的降解不可逆转。在OA的病程中早期软骨合成占优势，时间的延长还是不可避免的发生软骨的分解。
　　（3）通过阻断 Wnt/β-catenin信号通路后，OA早期上调了 Sox9的表达，Sox9的上调导致了II型胶原和聚蛋白多糖（Aggrecan）的表达的上调，这表明阻断Wnt/β-catenin通路以上调Sox9可能对软骨具有一定的保护和修复作用。

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英文摘要

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序 言

第一部分 实验性大鼠骨关节炎模型的建立

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

第二部分 Sox9在大鼠骨关节炎软骨中的表达及

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

研究小结

综 述

攻读学位期间公开发表的论文

致谢