过表达CX45对生物起搏样细胞通信连接的影响

摘要

目的：应用大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）为生物起搏的平台，通过慢病毒载体转染获得高表达超级化激活环核苷酸门控阳离子通道基因亚型1（hHCN1）和超级化激活环核苷酸门控阳离子通道基因亚型4（hHCN4）的MSCs，将其与心室肌细胞共培养，构建具有自律性的生物起搏样细胞；并且探讨过表达连接蛋白45（CX45）对生物起搏样细胞通信连接的影响。
　　方法：
　　1.用包含hHCN1和hHCN4慢病毒载体pCH1-GFP-hHCN1和pCH1-GFP-hHCN4转染大鼠MSCs细胞，构建hHCN1+hHCN4+MSCs。同时，使用pCH1-GFP-hHCN1和pCH1-GFP-hHCN4以及不包含hHCN1和hHCN4的pCH1-GFP慢病毒载体分别转染大鼠 MSCs细胞，构建 hHCN1+hHCN4-MSCs， hHCN1-hHCN4+ MSCs和hHCN1-hHCN4-MSCs。通过倒置荧光显微镜初步观察hHCN1和hHCN4在MSCs中的表达情况，采用RT-PCR及Western blot法检测各组基因的表达情况。将上述四组细胞与心肌细胞共培养，通过光镜及膜片钳方法记录心肌细胞搏动频率变化。
　　2.使用脂质体2000介导pDsRED2-N1-RFP/Gja7转染hHCN1+hHCN4+MSCs，获得 CX45稳定表达 hHCN1+hHCN4+CX45+MSCs细胞株。同时将空质粒 pDsR ED2-N1-RFP转染hHCN1+hHCN4+MSCs，形成CX45-hHCN1+hHCN4+MSCs。使用RT-PCR及Western鉴定CX45的表达情况。采用划痕标记染料示踪技术记录生物起搏样细胞间通信连接的变化。与此同时，将三组细胞分别与心室肌细胞共培养，通过光镜观察心肌细胞自律性的变化。
　　结果：
　　1.将四组MSCs与3d心肌细胞共培养2d后发现，hHCN1+hHCN4+MSCs共培养组心肌细胞搏动频率最快，102±13次/分；明显快于其他三组细胞，P＜0.05。hHCN1-hHCN4+MSCs共培养组心肌细胞搏动频率次之，94±16次/分，hHCN1+hHCN4-MSCs共培养组心肌细胞搏动频率为88±14次/分，hHCN1-hHCN4-MSCs共培养组心肌细胞搏动频率为78±14次/分。
　　2.划痕标记染料示踪技术证实了CX45+hHCN1+hHCN4+MSCs组缝隙连接通信下降，荧光染料传导至划痕附近第2列至第3列细胞，CX45-hHCN1+hHCN4+MSCs及空白对照组细胞荧光传至第1列至第2列细胞。三组细胞与心肌细胞共培养发现， hHCN1+hHCN4+CX45+MSCs共培养组心肌细胞搏动频率最快，120±18次/分；hHCN1+hHCN4+CX45-MSCs共培养组心肌细胞搏动频率次之，106±15次/分；空白对照组MSCs共培养组心肌细胞搏动频率最慢，86±16次/分。三组比较差异具有统计学意义，P＜0.05。
　　结论：hHCN1和 hHCN4基因共同转染MSCs细胞构建的起搏样细胞，能够提高生物起搏器自律性；同时过表达CX45的生物起搏样细胞，增加了生物起搏器模型的缝隙连接的通透性，提高生物起搏器的自律性。

目录

封面

中文摘要

英文摘要

目录

前 言

第一部分 生物起搏样细胞的建立

一、材料和方法

二、结 果

讨 论

参考文献

第二部分 过表达CX45对生物起搏样细胞缝隙连接的影响

一、材料和方法

二、结 果

讨 论

参考文献

结 论

综 述

中英文对照缩略词表

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