环巴胺衍生物对乳腺癌生长、转移和放射敏感性影响及机制的研究

摘要

恶性肿瘤是危害人类健康最为严重的疾病之一。在过去30年中，中国居民的恶性肿瘤死亡率增长了80%以上。恶性肿瘤目前已经成为城市居民的首位死因及农村居民第二位死亡原因。恶性肿瘤中，乳腺癌是目前威胁女性健康的最主要肿瘤。2010年美国癌症学会研究统计数据显示，世界女性恶性肿瘤发病率占第一位的是乳腺癌，其死亡率居排女性恶性肿瘤的第二位。
　　手术、放疗和化疗为目前乳腺癌治疗的三大主要手段，虽然乳腺癌的治疗较前已得到一定的进步，但对降低乳腺癌患者的死亡率改善不大，多数乳腺癌病人发现时已属肿瘤中晚期，失去了手术根治的机会，化疗和放疗对改善病人的生活质量，延长这些病人的生存时间意义重大。因此，开发、研究新的化疗及放疗增敏药物是放射生物学研究的新方向。
　　环巴胺(cyclopamine)是一种从藜芦类植物中提取的甾体类化合物，已报道其具有非常好的抑制肿瘤生长和转移的抗肿瘤作用，而且其抗肿瘤作用具有广谱性，可以抑制多种肿瘤细胞的生长。而且联合应用可以增加肿瘤细胞的化疗和放疗的疗效。但是环巴胺不溶于水，也很难溶解在有机或者无机溶剂中，这大大地限制了环巴胺将来在临床的广泛应用。本实验室通过改变环巴胺的局部化学结构，改改善了它的溶解性，并得到一系列环巴胺衍生物，命名为SCJ。本课题是研究环巴胺衍生物 SCJ在乳腺癌细胞中的生物学功能以及相关机制，旨为进一步开展环巴胺衍生物抗肿瘤作用的基础和临床研究提供实验基础和依据。本课题实验内容主要分为三大部分：
　　第一部分 SCJ对乳腺癌细胞生长和转移影响的研究
　　目的：
　　研究环巴胺衍生物SCJ-26和SCJ-43在体外对乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7生长和转移的影响，并初步探讨其机制。
　　方法：
　　应用倒置显微镜观察不同浓度 SCJ-26和 SCJ-43作用后 MDA-MB-231、MCF-7细胞细胞形态的变化。应用MTT法检测不同浓度SCJ药物对两种细胞的生存曲线的影响。通过贴壁实验来观察不同浓度 SCJ药物对乳腺癌细胞贴壁能力的影响。应用划痕实验检测SCJ药物对乳腺癌细胞体外迁移能力的影响。应用Boyden小室实验研究 SCJ药物对乳腺癌细胞体外转移能力的影响。应用流式细胞术分析SCJ药物引起两种细胞细胞周期的变化。应用Western blot实验检测不同浓度SCJ药物作用于MDA-MB-231、MCF-7细胞后，细胞周期、凋亡及表皮生长因子受体相关蛋白的变化。
　　结果：
　　细胞培养直接镜检及染色结果显示，与 MDA-MB-231和 MCF-7细胞比较， SCJ-26和SCJ-43处理组的细胞持续贴壁生长减少，细胞间间隙增多，细胞轮廓逐渐模糊，细胞胞浆肿胀。随着SCJ-26和SCJ-43浓度的升高，上述细胞形态表现更明显，存在一定的浓度-效应关系。可见，SCJ药物抑制了两种细胞的存活率，延长了细胞的贴壁时间，降低了贴壁率，抑制了细胞的迁移和转移能力。FCM结果显示，SCJ药物处理后，MDA-MB-231和MCF-7细胞均发生G2期阻滞。Western blot结果显示，SCJ药物处理后，MDA-MB-231和MCF-7细胞的Cyclin D1、Cyclin B1及Bcl-2蛋白表达均发生了下调，而E-Cadherin蛋白表达升高。相比同浓度的环巴胺，SCJ-26和SCJ-43对MDA-MB-231和MCF-7细胞的药物作用更强，且随着SCJ药物浓度变化，存在浓度-效应关系。
　　第二部分 SCJ对乳腺癌细胞辐射敏感性影响及机制的研究
　　目的：
　　研究SCJ-26和SCJ-43对乳腺癌细胞MDA-MB-231及MCF-7辐射敏感性方面的实验，并对其机制进行初步探讨。
　　方法：
　　对经不同浓度SCJ-26和SCJ-43处理后的乳腺癌MDA-MB-231及MCF-7细胞应用不同剂量的c射线照射后，进行克隆形成实验，观察SCJ药物对乳腺癌细胞放射敏感性的影响。应用流式细胞术观察 SCJ药物对乳腺癌细胞 MDA-MB-231及MCF-7受照后细胞周期变化的影响。应用Western blot检测SCJ药物对两种乳腺癌细胞受照后周期相关蛋白和辐射相关蛋白的影响。
　　结果：
　　MDA-MB-231和MCF-7两种细胞均观察到，和对照组、单加SCJ-26或SCJ-43组及单照射组相比，SCJ药物处理+照射组的细胞存活曲线明显降低，G0/G1期和G2/M期细胞比例升高，且有明显的sub G1峰。凋亡相关蛋白Bax蛋白表达增高，周期相关蛋白Cyclin D1蛋白表达降低；辐射相关蛋白XRCC1蛋白、Ku-70蛋白和FEN-1蛋白表达均下调。随着SCJ-26和SCJ-43浓度升高，上述变化更为明显，存在一定的浓度-效应关系。相比同浓度的环巴胺， SCJ-26和 SCJ-43对MDA-MB-231和MCF-7两种细胞经c射线照射后的抑制作用更强。
　　第三部分 SCJ对乳腺癌裸鼠异种移植瘤生长和转移影响的研究
　　目的：
　　通过建立乳腺癌MDA-MB-231细胞的裸鼠移植瘤模型，观察SCJ-26和SCJ-43对乳腺癌细胞在裸鼠的局部成瘤性及远处转移能力的影响。
　　方法：
　　将乳腺癌MDA-MB-231细胞悬液接种于BALB/c雌性裸鼠腋下乳房脂肪垫，建立裸鼠移植瘤模型，同时分设对照组及不同浓度 SCJ药物处理组。药物处理组按组每日灌胃喂饲相应浓度的SCJ药物，观察移植瘤形成率，观察肿瘤生长速率，定期测量肿瘤大小；4周后处死实验裸鼠，观察裸鼠肺脏和肝脏的远处转移情况。将乳腺癌MDA-MB-231细胞通过尾静脉注射，建立裸鼠肺转移模型，并设对照组及不同浓度SCJ-26和SCJ-43药物处理组，观察SCJ药物处理组对乳腺癌细胞在裸鼠形成肺转移结节能力的影响。
　　结果：
　　通过BALB/c雌性裸鼠乳房接种乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7细胞，成功建立了裸鼠乳腺癌转移瘤模型。与无药物处理裸鼠的对照组相比，SCJ-26和SCJ-43各浓度处理组两种乳腺癌细胞局部出瘤率明显下降，且肿瘤大小和体积均明显减小。随着SCJ浓度升高，裸鼠出瘤率和肿瘤大小均减少，二者存在一定的浓度-效应关系。MDA-MB-231细胞原位种植肝转移只发生在空白裸鼠对照组（2/6），其余组未发现。通过裸鼠尾部静脉注射MDA-MB-231细胞，成功建立了裸鼠肺转移模型。与空白裸鼠组相对照，SCJ-26或SCJ-43各浓度处理组裸鼠发生肺转移明显减少，转移的平均肺结节数也明显减少。随着 SCJ浓度升高，肺结节数量逐渐减少，二者存在浓度-效应关系。
　　结论
　　(1) SCJ-26和SCJ-43在体外可以抑制乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231的增殖能力、贴壁能力、迁移和转移能力，导致两种乳腺癌细胞细胞周期G2/M期阻滞，机制可能与其下调Cyclin D1、Cyclin B1及Bcl-2蛋白，上调E-Cadherin蛋白有关。在相同浓度下，SCJ-26和SCJ-43两种药物的抗肿瘤作用明显优于环巴胺。
　　(2)在无影响细胞生长的低浓度下，SCJ-26和 SCJ-43药物可以明显增加乳腺癌细胞的放射敏感性，其机制可能与上调 Bax基因促进受照后细胞凋亡，下调Cyclin B1蛋白使细胞发生G2期阻滞，同时辐射损伤修复相关蛋白Ku-70蛋白、FEN-1蛋白和XRCC1蛋白下调有关。同样，SCJ-26和SCJ-43增加乳腺癌细胞对射线敏感性的作用疗效明显强于环巴胺。
　　(3)在动物体内试验，SCJ-26和SCJ-43都可以降低乳腺癌细胞在裸鼠体内的成瘤率，同时降低了移植瘤在裸鼠体内的生长速度。SCJ-26和 SCJ-43可以抑制MDA-MB-231细胞的体内的远处转移能力。SCJ-26和 SCJ-43的体内抗肿瘤和抑制肿瘤转移能力和作用明显强于环巴胺。

目录

封面

中文摘要

英文摘要

前言

参考文献

第一部分 SCJ对乳腺癌细胞生长和转移影响的研究

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 SCJ对乳腺癌细胞辐射敏感性影响

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 SCJ对乳腺癌细胞辐射敏感性影响及机制的研究

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

结论

综述

白黎芦醇抗肿瘤作用及其机制概述

参考文献

英文缩写

攻读学位期间学术活动总结

致谢