紫外及甲基磺酸乙酯诱变选育竹红菌甲素高产菌株的研究

摘要

竹黄菌(Shiraia bambusicola P. Hennigs)是一种稀有的寄生性药用真菌,其子实体是传统的中药-竹黄资源,近期研究发现竹黄苝醌类有效成分-竹红菌素具有抗炎、抗菌、镇痛、局麻及抗肿瘤的作用,而且已成为抗菌和抗肿瘤的临床光疗药物。但由于野生竹黄采收期短、产量低,竹红菌素、竹黄多糖及其他活性成分的研究和生产都受到了极大的限制。为了综合开发利用竹黄菌,本文开展了竹黄菌的无性系培养,并通过物理(紫外线)和化学(甲基磺酸乙酯)处理技术,对竹黄菌开展诱变育种研究,以期选育得到遗传稳定的竹红菌甲素高产菌株,为竹黄菌的生物技术生产和竹红菌素药物资源的开发提供技术和参考,同时竹黄菌的生物技术培养也有利于对野生竹黄菌的资源保护。
　　本研究首先开展了竹黄菌Shiraia sp. S8菌株培养、菌丝中竹红菌甲素的提取分离和竹黄菌的液体发酵培养,通过筛选和优化了竹黄菌产竹红菌素培养基碳源、氮源及不同培养时间、起始pH值及装液量条件,筛选出优化的培养基和发酵条件,培养基为马铃薯20％,葡萄糖2%,KH2PO40.3%,MgSO40.15%,维生素B10.001%,酵母膏0.5%。最佳发酵条件为:起始pH值为6.0,装液量200 mL/500 mL,并在培养10 d后收获竹黄菌菌丝体。
　　其次开展了竹黄菌Shiraia sp. S8菌株的原生质体形成条件的研究,探索出竹黄菌原生质体形成的最适条件:液体培养菌丝体菌龄50 h,5 mg/mL纤维素酶和10 mg/mL蜗牛酶(终浓度)混合酶系,酶解时间2 h,酶解温度30℃。在此条件下原生质体产量可以达到3.24×106个/mL,再生率可以达到3.5%。
　　竹黄菌Shiraia sp. S8菌株原生质体经紫外线(距离15 W紫外灯30 cm处)照射处理0.5-2 min,原生质体再生后经筛选得到一株竹红菌甲素高产诱变菌株C6,其遗传稳定性良好,产量与S8菌株相比提高53.7%,达到28.1 mg/L。
　　本研究以S8菌株为出发菌株,用0.5-2.5%甲基磺酸乙酯(EMS)处理竹黄菌悬浮孢子10-30 min,结合平板色素圈大小初筛和高效液相色谱(HPLC)分析进行复筛,经诱变筛选得到高产菌株10-5,竹红菌甲素产量达到26.8 mg/L,与原始出发菌株提高了46.4%,且经过连续传代5次,生长性状和竹红菌甲素产量稳定。

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第一章 绪 论

1.1 竹黄菌简介

1.2 竹红菌素简介

1.3 竹红菌素的应用

1.4 竹红菌素高产菌株的诱变筛选技术

1.5 本课题研究主要内容与意义

第二章 竹黄菌液体发酵生产竹红菌素

2.1 引言

2.2 实验材料与设备

2.3 实验方法

2.4 结果与讨论

2.5 本章小结

第三章 竹黄菌原生质体的制备与再生

3.1 引言

3.2 实验材料与设备

3.3 实验方法

3.4 结果与讨论

3.5 本章小结

第四章 竹黄菌原生质体紫外诱变与筛选研究

4.1 引言

4.2 实验材料与设备

4.3 实验方法

4.4 结果与讨论

4.5 本章小结

第五章 甲基磺酸乙酯诱变选育竹红菌甲素高产菌株

5.1 引言

5.2 实验材料与设备

5.3 实验方法

5.4 结果与讨论

5.5 本章小结

论文总结与展望

参考文献

攻读学位期间发表的论文

附录

致谢