转录后调控SOD1增加肿瘤细胞放射效应影响的研究

摘要

目的:目前克服肿瘤细胞放射抗拒性策略较多,但效果欠佳。研究发现SOD1高表达是肿瘤对放化疗抵抗的重要机制之一,但SOD1高表达的机制不明。基因表达的精细调控多与3’UTR的转录后调控有关,但关于肿瘤SOD1的转录后调控报道较少,因此本课题拟探讨肿瘤SOD1转录后调控机制及其对肿瘤反射效应的影响,为以SOD1为靶标的放疗增敏策略提供理论基础。
　　方法:本课题主要以卵巢癌细胞系A2780和胰腺癌PANC1为模型,(1)构建SOD-3’UTR的荧光素酶报告载体,观察SOD1、SOD2-3’UTR在肿瘤细胞对荧光素酶活性的影响,以及在过氧化氢和X射线作用下的变化;并应用RT-PCR和蛋白印迹法验证肿瘤细胞在过氧化氢作用下SOD1mRNA和蛋白表达水平的变化。
　　(2)比较SOD1-3’UTR在两种肿瘤细胞中对荧光素酶活性的影响,并应用 RT-PCR法检测萤火素酶mRNA的水平;并进一步应用蛋白印迹法观察外源SOD-3’UTR对内源性SOD蛋白表达的影响。构建不同的SOD1-3’UTR荧光素酶报告载体,包括含有不同AREs的、miRNA(miR-224、-377、-621)结合位点缺失的、单个或多个AREs联合缺失的3’UTR载体,或应用miRNA的拟似物或抑制剂等观察RNA元件对3-‘UTR所介导的荧光素酶性的影响,或SOD1蛋白表达的变化。构建SOD1-Promoter-SOD1-3’UTR荧光素酶报告载体,进一步对该载体进行AREs缺失突变,检测X射线处理后荧光素酶活性的变化。
　　(3)RNA干扰技术下调AUF1或外源真核表达上调AUF1,观察其对SOD1蛋白表达的变化;以及SOD1-3’UTR所介导的荧光素酶活性的变化;并观察AUF1下调对肿瘤细胞ROS水平的影响;进一步应用RNA免疫共沉淀检测AUF1与SOD1-3’UTR的直接作用;免疫组化法检测胰腺癌标本中AUF1和SOD1蛋白的表达。
　　结果:(1)SOD1、SOD2-3’UTR正义载体与反义载体相比,荧光素酶活性增加近20倍;过氧化氢100μM明显增加了A2780细胞内SOD1、SOD2-3’UTR所介导的荧光素酶活性;10Gy射线明显增加了A2780细胞内SOD1-3’UTR所介导的荧光素酶活性;过氧化氢100μM增加了A2780细胞SOD1mRNA和蛋白表达水平。
　　(2)在A2780和PANC1细胞内SOD1-3’UTR正义载体相比反义、空载体的荧光素酶活性明显增加;SOD1-3’UTR增加了A2780细胞萤火素酶mRNA的水平;外源SOD-3’UTR降低了A2780细胞内源性SOD蛋白的表达,并且外源SOD1-3’UTR能降低内源性SOD2蛋白的表达;逐步的对SOD1-3’UTR作片段的截断后结果显示荧光素酶活性也逐渐降低;miR-224,miR-377结合位点的缺失导致荧光素酶活性显著下降,而miR-621结合位点的缺失未见明显变化;miR-377或miR-621的拟似物或抑制剂并没有显著影响内源性SOD1的表达,也没有影响SOD1-3’UTR所介导的荧光素酶活性;任一个ARE的缺失均能降低荧光素酶活性,以ARE6的作用最强;但当载体仅包含2个或4个ARE本身的序列时荧光素酶活性几乎测不出。ARE6的缺失逆转了X射线诱导的SOD1-Promoter-SOD1-3’UTR所介导的荧光素酶活性的增加。
　　(3)AUF1的下调明显降低了SOD1蛋白的表达水平,而HuR的下调对SOD1蛋白表达的影响不大,并与荧光素酶活性的结果一致;AUF1的高表达增加了这两种细胞系内的SOD1-3’UTR介导的荧光素酶活性;RT-PCR法仅能从AUF1沉淀物中检测到SOD1-3’UTR的表达;93例胰腺癌组织标本检测的结果显示AUF1和SOD1的蛋白表达明显相关。
　　结论:(1)SOD1-3’UTR与肿瘤细胞基础和应激状态下SOD1的表达相关。
　　(2)SOD1-3’UTR能增加肿瘤细胞SOD1mRNA的稳定性,并与ARE特别是ARE6相关,与所检测的miRNA结合位点相关的可能性不大。
　　(3)AUF1通过与SOD1-3’UTR结合影响肿瘤SOD1表达是SOD1转录后调控的机制之一,并能影响肿瘤细胞基础的和放射诱导的ROS水平。

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引言

参考文献

第一部分 3’UTR 对肿瘤细胞SOD表达的影响

引言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 3’UTR中RNA元件对肿瘤细胞SOD1表达的影响

第一节 外源性SOD-3’UTR对肿瘤细胞内源性SOD表达的影响

第二节、3’UTR中RNA元件对肿瘤细胞SOD1表达的影响

参考文献

第三部分 RNA结合蛋白AUF1对肿瘤细胞SOD1表达及放射效应的影响

引言

结果

讨论

参考文献

结论

四、附录

发表论文及其它

综述

致谢