GATA-3基因多态性与LAPTM5基因功能在儿童白血病中的研究

摘要

本论文包括四个部分:
　　第一部分：GATA-3 SNP rs3824662与中国儿童急性淋巴细胞白血病的相关性
　　目的:研究GATA结合蛋白3(GATA-binding protein-3, GATA-3)SNP rs3824662在中国儿童急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia, ALL)中的分布,分析其与中国儿童急性淋巴细胞白血病的相关性。
　　方法:收集137例中国儿童ALL患者及389例非血液系统恶性疾病人员EDTA抗凝静脉血,提取DNA,采用巢式PCR扩增包含GATA-3 SNP rs3824662位点的特异性条带后送公司测序,对其进行单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)分析。SPSS18.0分析软件对数据进行分析。
　　结果:基因型C-C、C-A和A-A及等位基因C、A在对照和中国儿童ALL中比例没有差异,且与ALL的临床指标没有相关性。
　　结论: GATA-3 SNP rs3824662位点的多态性改变与中国儿童ALL的发病没有相关性,提示该位点与中国儿童ALL发病机制无关。
　　第二部分：儿童急性淋巴细胞白血病患者LAPTM5基因的表达及临床意义
　　目的:溶酶体相关的五次跨膜蛋白(lysosomal-associated protein transmembrane5, LAPTM5)功能尚不十分明了,本研究通过定量 PCR检测儿童急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia, ALL)患者骨髓标本中LAPTM5 mRNA的相对表达量,回顾性的分析其表达水平与儿童ALL临床特征的相关性。
　　方法:病例来源于2012-2013年期间在苏州大学附属儿童医院诊断和治疗的ALL患者144例(初诊82例、完全缓解54例、复发8例);40例对照为同期的特发性血小板减少性紫癜(Idiopathic Thrombocytopenic Purpura, ITP)或细胞株。应用定量RT-PCR方法检测LAPTM5基因的mRNA表达水平,利用SPSS18.0统计学软件,分析LAPTM5在儿童ALL中的意义。
　　结果:初诊患儿LAPTM5 mRNA的相对表达水平高于对照组,且差异有统计学意义(P<0.001);在ALL患者中,初诊组和复发组LAPTM5 mRNA的表达水平均明显高于缓解组(P<0.001,P=0.006),复发组与初诊组间没有差异(P=0.171),复发组高于对照组,差异有统计学意义(P=0.033),缓解组与对照组之间无差异(P=0.985)。初诊B-ALL中LAPTM5的表达明显高于儿童初诊T-ALL患者。LAPTM5的表达与骨髓原始细胞比例呈正相关(P=0.034, r=0.303);与年龄、性别、初诊白细胞计数(WBC)、血红蛋白(HB)、血小板(PLT)、C反应蛋白(CRP)、乳酸脱氢酶(LDH)、外周血幼稚细胞比例没有相关性,与儿童ALL的早期治疗反应及危险度分级也没有相关性;与诱导缓解治疗33天时MRD的表达水平无相关性(P=0.695,r=-0.055)。
　　结论:儿童初诊ALL高表达LAPTM5基因,在B-ALL中的表达高于T-ALL,与骨髓中白血病细胞数具有正相关性,但与疾病的预后指标没有相关性。
　　第三部分：溶酶体五次跨膜蛋白基因的慢病毒载体的构建及在K562细胞中的表达
　　目的:构建溶酶体相关五次跨膜蛋白(lysosomal-associated protein transmembrane5, LAPTM5)基因的慢病毒表达载体,为研究该基因在白血病细胞中的功能奠定基础。
　　方法:以NB4细胞的cDNA为克隆模板,通过Primer Premier5软件设计含有EcoRⅠ和 BamHⅠ酶切位点的基因克隆引物,将LAPTM5 CDS区域克隆入pLVX-IRES-Puro慢病毒表达载体。利用pLVX、pLP-VSVG、pLP1、pLP2慢病毒质粒包装系统,在293T细胞中采用磷酸钙沉淀法包装 LAPTM5过表达慢病毒后侵染K562细胞,并对LAPTM5过表达慢病毒进行一系列验证。
　　结果:经过PCR方法,有效扩增了LAPTM5基因编码区,构建了pLVX/LAPTM5慢病毒表达载体,测序分析表明所克隆的LAPTM5基因编码区序列无误。DNA水平鉴定表明LAPTM5基因已成功插入到K562细胞基因组中,且在mRNA和蛋白水平较亲本株和转空载体细胞高表达。
　　结论:成功地构建了人 LAPTM5的慢病毒表达载体 pLVX/LAPTM5,为进一步研究LAPTM5在白血病细胞中的功能奠定了实验基础。
　　第四部分 LAPTM5基因对K562细胞自噬及凋亡的影响
　　目的:LAPTM5是溶酶体的重要组成部分,溶酶体是介导自噬的重要器官,本研究通过观察过表达LAPTM5基因的K562细胞自噬及凋亡,探讨LAPTM5基因在K562细胞中的可能作用。
　　方法:1.用HBSS代替1640完全培养基分别对转空载体pLVX的K562细胞和转LAPTM5基因的K562细胞进行饥饿处理,于处理后0h、3h、6h收集细胞,提取蛋白后蛋白印迹检测LC3-II、LC3-I的表达,并比较其比值。2.使用携带FITC的LC3抗体标记转空载体pLVX的K562细胞和转LAPTM5基因的K562细胞后用成像流式细胞仪检测带荧光斑点的细胞。3.使用LysoSensor? Green DND-189标记溶酶体,流式细胞仪检测转空载体pLVX的K562细胞和转LAPTM5基因的K562细胞,根据荧光强度判断溶酶体的酸性程度。4.使用 Annexin V-FITC/PI标记转空载体 pLVX的K562细胞和转LAPTM5基因的K562细胞后,流式细胞仪检测细胞的凋亡。
　　结果:1.细胞于饥饿处理0h、3h、6h后,转LAPTM5基因的K562细胞LC3-II/LC3-I比值均低于转空载体pLVX的K562细胞。2.转空载体的K562细胞的多数量荧光斑点的细胞比率占83.1％,转LAPTM5基因细胞的多数量荧光斑点的细胞比率占57％。3.转空载体的K562细胞的荧光强度明显强于转LAPTM5基因细胞荧光强度。4.转LAPTM5基因细胞的凋亡率为33.1％,.转空载体的K562细胞凋亡率为34.2％。
　　结论:LAPTM5基因能够抑制K562细胞的自噬而不影响其凋亡。

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引言

第一部分 GATA-3 SNP rs3824662与中国儿童急性淋巴细胞白血病的相关性

对象和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 儿童急性淋巴细胞白血病患者LAPTM5基因的表达及临床意义

对象和方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 溶酶体五次跨膜蛋白基因的慢病毒载体的构建及在K562细胞中的表达

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第四部分 LAPTM5基因对K562细胞自噬及凋亡的影响

材料与方法

结果

讨论

参考文献

综述

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