减毒沙门氏菌为载体的CEACAM6联合4-1BBL基因疫苗对实验性大肠癌生长的影响

摘要

本文从以下几部分进行了论述。
　　第一部分:重组大鼠pIRES-CEACAM6-4-1BBL真核表达载体的构建及功能鉴定
　　目的:构建含pIRES-CEACAM6-4-1BBL的真核表达质粒。
　　方法:从大鼠睾丸中克隆出大鼠CEACAM6基因全长,联合本实验室先前保存的4-1BBL基因,构建质粒并通过脂质体转染COS7细胞,免疫双荧光法检测目的蛋白CEACAM6、4-1BBL的表达。
　　结果:成功构建三个质粒:pIRES-CEACAM6、pIRES-4-1BBL、pIRES-CEACAM6-4-1BBL,并通过脂质体转染COS7细胞,证明重组质粒能表达相应的基因。
　　结论:成功构建了携带大鼠4-1BBL和CEACAM6基因的真核表达质粒。
　　第二部分:含pIRES-CEACAM6-4-1BBL质粒减毒沙门氏菌构建及功能鉴定
　　目的:构建含pIRES-CEACAM6-4-1BBL质粒减毒沙门氏菌。
　　方法:将质粒转入鼠伤寒沙门氏菌(LB5000)进行甲基化,利用修饰后重组质粒转化终宿主菌SL3261,筛选后挑取单克隆扩增进行抽提质粒和PCR鉴定。
　　结果:导入质粒的SL3261经抽提质粒PCR电泳后获得了同原转化质粒相同大小的目的条带。
　　结论:成功构建了含大鼠4-1BBL和CEACAM6基因的真核表达质粒的SL3261疫苗菌。
　　第三部分:含pIRES-CEACAM6-4-1BBL质粒减毒沙门氏菌对大鼠大肠癌生长的影响
　　目的:探讨减毒沙门氏菌为载体的CEACAM6联合4-1BBL基因疫苗对荷瘤大鼠免疫系统的影响及治疗大肠癌可行性。
　　方法:利用1,2-二甲肼连续18周皮下注射建立大鼠大肠癌模型,第8w、第10w和第12w及第16w根据分组灌服四次含质粒减毒沙门氏菌,18周处死大鼠,解剖并观察成瘤数量并进行Dukes分期评判;流式细胞仪检测外周血和和脾脏中细胞表型并利用PHA刺激脾细胞分泌IFN-γ水平,RT-PCR检测脾脏细胞中真核表达载体CMV的转录。
　　结果:对照组平均成瘤数为11.7±2.1个,明显高于pIRES-CEACAM6/SL3261的5.0±1.4,pIRES-4-1BBL/SL3261的5.7±1.2, pIRES-CEACAM6-4-1BBL/SL3261的4.3±1.4,其中以pIRES-CEACAM6-4-1BBL/SL3261组最为明显,外周血和脾脏细胞表型检测显示活化T细胞较其它荷瘤组明显增高(P<0.05),脾细胞PHA刺激试验后分泌IFN-γ的能力也明显增强(P<0.05)。
　　结论:减毒鼠伤寒沙门氏菌介导和双表达载体将大鼠CEACAM6和4-1BBL基因体内转染抗原递呈细胞,通过活化T细胞,诱导CD8+细胞毒T细胞(CTL)的产生和细胞因子IFN-γ的分泌,发挥抗肿瘤作用。

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前言

第一部分 重组大鼠pIRES-CEACAM6-4-1BBL真核表达载体的构建及功能鉴定

一、材 料

二、方 法

三、结 果

讨论

第二部分 含pIRES-CEACAM6-4-1BBL质粒减毒沙门氏菌构建及功能鉴定

一、材 料

二、方 法

三、结 果

讨论

第三部分 含pIRES-CEACAM6-4-1BBL质粒减毒沙门氏菌对大鼠大肠癌生长的影响

一、材 料

二、方 法

三、结 果

讨论

参考文献

全文总结

综述

英文缩略词表

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