bdnf基因转录的表观遗传调控在电离辐射所致神经发生损伤及认知功能障碍过程中的作用研究

摘要

第一部分电离辐射诱导大鼠急性认知功能障碍的剂量学研究及早期表观遗传学变化特征的研究
　　实验目的:对于鼻咽癌、胶质瘤、大脑原发性恶性肿瘤以及脑转移瘤等头颈部肿瘤等常见癌症来说，放射治疗已经成为不可或缺的手段，且疗效显著，使得患者生存期明显延长。但是放射治疗对正常脑组织的毒副反应也严重影响了患者的生活质量。因此，头颈部肿瘤放疗引起的并发症逐渐引起大家的关注，急性和慢性认知功能缺陷逐渐成为关注的焦点，特别是急性认知功能缺陷已成为提高头颈部肿瘤治疗疗效的主要制约因素。但是对于照射引起的认知功能损伤，目前仍没有有效地治疗手段。因此，随着注重患者生活质量理念的推广，十分有必要开展针对放射性认知损伤防治策略的研究。本文主要研究导致实验大鼠急性认知功能障碍的剂量学特点，并探讨可能与之相关的早期分子生物学变化特征。
　　材料和方法:实验所用动物为体重150-200g的雄性Sprague Dawley大鼠，应用4MeV电子线以单次剂量0Gy、2Gy、10Gy、30Gy进行全脑照射，制备大鼠的脑放射诱导损伤模型。随机分为空白对照(0Gy)组和2Gy、10Gy、30Gy剂量组。实验大鼠在照射后30天，分别应用开放场实验、Morris水迷宫、避暗实验检测自发运动能力和焦虑状态、空间学习记忆能力以及记忆保持能力，评价不同剂量全脑照射对大脑认知功能的影响。分别于照射后7天和30天提取海马组织蛋白进行western blot分析，检测海马区组蛋白H3乙酰化以及组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs) HDAC1、HDAC2的变化。应用冰冻切片机切取30μm冰冻切片进行免疫荧光染色，分别用anti-ac-H3和DAPI进行荧光染色，激光共聚焦显微镜观察实验结果，计数anti-ac-H3+/DAPI+作为统计指标。
　　结果:1）开放场实验主要检测实验动物的自发运动和情绪状态，实验结果显示照射组大鼠和对照组的大鼠没有显著差别。Morris水迷宫主要检测空间记忆能力，定向航行实验显示30Gy组的大鼠寻找到隐匿平台的潜伏期明显长于对照组(Kruskal-Wallis test, P＜0.01)，2Gy、10Gy组与对照组相比无明显差别，说明30Gy全脑照射导致了大鼠的空间记忆能力降低。避暗实验是一种检测实验动物记忆过程较为敏感的测试，特别是对于记忆维持能力，我们的实验显示全脑单次30Gy照射后，大鼠进入暗箱从而遭受到电击的潜伏期明显短于对照组(Kruskal-Wallis test, P＜0.01)，说明记忆维持能力受到明显影响。2Gy、10Gy组与对照组相比无明显差别。2）westernblot分析证明，给予实验大鼠30Gy单次全脑照射后7天，海马区组蛋白H3乙酰化水平即发生显著下降，到30天进一步降低。30Gy全脑照射后7天和30天，海马脑区组蛋白H3乙酰化水平分别降低了30％(Kruskal-Wallis test，P＜0.05)和61％(Kruskal-Wallis test, P＜0.01)。这个结果经免疫荧光染色进一步证实，30Gy照射后ac-H3+/DAPI+较对照组明显降低。3）组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)在照射后7天表达量升高，照射后30天明显高于对照组（t检验，P＜0.05）。而HDAC2在30Gy照射后，对照组和实验组没有明显的差别。
　　结论:单次30Gy全脑照射足够成功诱导大鼠的急性认知功能障碍，从而为后续的研究提供了有用的动物模型。而以往研究中常用的2Gy、10Gy单次剂量照射不足以引起大鼠急性认知功能障碍的发生。同时发现30Gy导致海马区组蛋白H3乙酰化水平在照射后较短时间内即呈现显著下降，与组蛋白去乙酰化酶HDAC1表达成负相关，提示全脑照射后早期组蛋白H3乙酰化等表观遗传学的变化可能参与电离辐射所致认知功能障碍的发生过程。
　　第二部分全脑照射所致大鼠海马区神经发生损伤与bdnf基因转录的表观遗传调控机制相关
　　实验目的:临床资料显示，对于接受放射治疗后长期生存的癌症患者，电离辐射引起的认知功能障碍严重影响了患者的生活质量(quality of life，QOL)。越来越多的研究证据表明大脑海马区神经发生(neurogenesis)发挥关键作用。尽管电离辐射导致神经发生障碍的发病机制仍不清楚，但是可能涉及脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）。神经生物学的研究表明BDNF在海马齿状回(DG)高度表达，通过与其特异性受体TrkB受体结合在突触可塑性和神经元发育过程中发挥重要作用。在第一部分实验的基础上，本研究旨在探讨bdnf基因和BDNF-TrkB信号通路参与辐射诱导的神经发生障碍的可能性，并分析组蛋白乙酰化和DNA甲基化对bdnf基因转录的影响，以期寻找到影响bdnf基因转录及神经发生的关键分子。
　　材料和方法:在第一部分关于导致实验大鼠急性认知功能障碍的剂量学研究中，我们证明了30Gy全脑照射可以诱导大鼠急性认知障碍，因此在本部分的研究中继续给予实验大鼠4MeV电子线30Gy单次剂量照射。在照射后7天和28天，应用免疫荧光染色方法分析海马区神经前体细胞增殖及新生神经元存活。应用5-bromo-2Vdeoxyuridine(BrdU)和NeuN标记新生神经元，共聚焦显微镜下计数BrdU+NeuN+细胞数作为统计新生神经元的指标。同时取同一批大鼠的海马组织提取mRNA和蛋白，应用RT-PCR和western blot分析BDNF及其受体Trk-B的表达。应用染色质免疫共沉淀(ChIP)和RT-PCR分析bdnf基因启动子区域组蛋白H3乙酰化。进一步检测bdnf基因CpG岛甲基化情况，我们选取该基因启动子区域以及第一、二外显子区域，总共约55942碱基对进行分析，采用的方法为亚硫酸氢盐测序分析(bisulfite-sequencing PCR，BSP)和甲基化特异PCR(MSP)。第一部分实验中我们发现组蛋白乙酰化降低是HDAC1依赖性的，因此我们给予实验大鼠皮下注射一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂-曲古霉素A(TSA)，检测TSA是否能够逆转bdnf基因转录及海马区神经发生损伤，从而验证HDAC1依赖的组蛋白H3乙酰化对bdnf基因转录及海马区神经发生的关键作用。
　　结果:免疫荧光染色显示全脑照射明显损伤了海马区新生神经元的产生和长期存活，这些变化与BDNF在mRNA及蛋白水平的表达相关。照射后7天，30Gy照射组大鼠海马区BrdU+NeuN+细胞数与对照组相比下降67％(P＜0.01)，在照射后28天，照射组大鼠基本无法观察到BrdU+细胞。同时western blot分析发现照射组大鼠海马区BDNF和Trk-b表达明显下降，BDNF在第7天和28天分别下降了33％(P＜0.05)和51％(P＜0.05)，其受体Trk-b分别下降了24％(P＜0.05)和35％(P＜0.05)。RT-PCR显示BDNF在mRNA水平也显著下降。ChIP分析证明了30Gy照射后bdnf基因启动子Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ组蛋白H3乙酰化水平明显下降。但是bdnf基因启动子及第一、二外显子CpG岛均未发现明显甲基化变化。在第一部分实验中我们发现电离辐射后组蛋白乙酰化变化是由HDAC1所介导，故给予照射组大鼠皮下注射HDAC1的抑制剂TSA进行干预实验。结果发现TSA组BDNF在mRNA和蛋白水平均明显高于照射组。注射TSA组的大鼠，海马区神经发生较对照组相比得到了明显保护。
　　结论:本研究第一次证明了电离辐射通过HDAC1依赖的组蛋白H3乙酰化的降低诱导了持续的bdnf基因转录的抑制，从而导致了海马DG区神经发生的长期损害。这些结果也提供了一种可能性，即通过抑制HDAC-1的表达来活化bdnf基因转录从而可以刺激神经元再生。这将有助于我们对于预防和治疗辐射相关的认知障碍制定新的策略。