新生大鼠高氧性肺损伤肺组织中AQPl、α-ENaC、SP-A的蛋白和mRNA表达及呋塞米雾化的干预作用

摘要

目的:
　　1.建立新生大鼠高氧肺损伤的动物模型;
　　2.观察和比较高氧性肺损伤时实验动物肺组织病理学改变,以及水通道蛋白-I(AQPl)、钠通道(α-ENaC)、肺表面活性物质相关蛋白A(SP-A)的mRNA及其蛋白的表达变化,从而探讨AQPK a-ENaC、SP-A在急性高氧性肺损伤发病机制中的作用;
　　3.探讨呋塞米雾化是否通过调控AQPI、α-ENaC、SP-A的表达从而发挥对高氧肺损伤的保护作用,为临床防治高氧性肺损伤提供理论依据。
　　方法:将110只出生一天内的新生Sprague Dawiey(SD)大鼠(雌雄不限)随机分为三组:I组:空气组(对照组,n=37);Ⅱ组:高氧组(高氧+生理盐水雾化, n=37);Ⅲ组:干预组(高氧+呋塞米雾化,n=36)。
　　Ⅰ组新生大鼠置于空气中饲养。Ⅱ组、Ⅲ组新生大鼠置于氧浓度维持在95％左右的氧箱中饲养。Ⅲ组于实验第一天起雾化吸入呋塞米(lmg/kg, qod),两天一次,共计七次。II组于实验第一天起同时间点雾化等量生理盐水。
　　每组按实验时间点分为3天、7天、14天三个亚组,并于各实验时间点随机取实验动物十二只,处死取材检测以下指标:
　　(1)肺泡灌洗液中总蛋白含量;
　　(2)左肺称取湿、干重,计算肺湿/干重比值;
　　(3)右上肺行病理切片后,观察肺组织病理改变;
　　(4)肺组织AQPl, α-ENaC, SP-A蛋白及mRNA含量测定:取相应肺组织提取蛋白,通过Western Blotting方法测定其蛋白含量;另外取相应肺组织提取RNA,通过RT-PCR方法测定m RNA表达水平。
　　结果:1.各组实验动物一般情况观察:Ⅰ组(空气组)中的实验动物反应好,生长发育正常。Ⅱ组(高氧组)中的实验动物逐渐出现症状,表现为皮毛无光泽,精神反应欠佳,脱氧后烦躁不安,呼吸困难明显,唇周发绀,其中一只实验动物死亡。而Ⅲ组(干预组)中的实验动物一般活动情况较高氧组明显改善,实验动物无死亡。
　　2.肺组织病理学改变:Ⅰ组(空气组)实验动物各时间点肺组织肺泡大小均一,肺泡腔内未及液体渗出、细胞浸润。Ⅱ组(髙氧组)实验动物在高氧暴露3天后,肺泡腔扩大,肺血管扩张充血,肺泡腔内出现红细胞、炎性细胞浸润。7天后可见肺组织水肿,结构紊乱,肺泡内出血、液体渗出、炎症细胞浸润明显加重,部分肺间隔增宽变形,肺组织结构紊乱。14天时更为明显,肺组织结构紊乱,肺间隔明显增厚,出现纤维化表现,肺泡数量明显减少,肺泡腔明显增大,可见肺大泡。Ⅲ组(干预组)肺组织各时相形态与结构改变均较高氧组明显减轻。
　　3.肺组织湿/干重比(W/D):在实验3天、7天、14天时, Ⅱ组(高氧组)实验动物肺组织W/D较I组(空气组)有升髙(P<0.05),而Ⅲ组(干预组)实验动物肺组织W/D较I I组(高氧组)明显降低(PC0.05)。
　　4.支气管肺泡灌洗液(BLAF)中总蛋白(TP)含量测定:在实验3天、7天、14天时, Ⅱ组(高氧组)实验动物的BLAF中TP含量明显高于Ⅰ组(空气对照组)(P<0.05),Ⅲ组(干预组)的BLAF中TP含量则明显低于II组(高氧组)(<0.05)。
　　5.肺组织中AQP1,α-ENaC, SP-A蛋白表达水平的变化:
　　(1)在实验第3天、7天时,Ⅱ组(高氧组)肺组织AQPl蛋白表达水平较I组(空气组)下降明显(P<0.01),14天时Ⅱ组(高氧组)肺组织AQPl的蛋白表达水平较前增加,但较Ⅰ组(空气组)仍有下降(p<0.055)。m组(干预组)肺组织AQPl蛋白表达水平在实验3天、7天及14天时均与Ⅰ组(空气组)接近,明显高于Ⅱ组(高氧组),差异有统计学意义(P<0.05)。
　　(2)在实验第3天、7天及14天时,Ⅱ组(高氧组)肺组织Oi-ENaC的蛋白表达水平较I组(空气组)明显下降(P<0.05),而m组(干预组)肺组织a-ENaC蛋白表达水平较Ⅱ组(高氧组)明显升高,其差异具有统计学意义(P<0.05)。
　　(3)在实验第3天时,Ⅱ组(髙氧组)肺组织SP-A蛋白表达水平较I(空气组)及Ⅲ组(干预组)明显升高(P<0.05),在实验第7天、14天时表达较I(空气组)及Ⅲ组(干预组)明显下降(P<0.05),而Ⅲ组(干预组)肺组织SPA蛋白表达水平与I组(空气组)接近,两者无统计学差异(P>0.05)。
　　6.肺组织中AQPl, α-ENaC, SP-A的mRNA表达水平的变化:在本实验中,通过RT-PCR方法检测显示:
　　(1)在实验第3天、7天及14天时,Ⅱ组(高氧组)肺组织AQPl及αa-ENaC的mRNA表达水平均较I组(空气组)明显下降(P<0.05),Ⅲ组(干预组)肺组织AQPi及α-ENaC的mRNA表达水平稍低于I组(空气组)(p>0.05),明显高于Ⅱ组(髙氧组),差异有统计学意义(P<0.05)。肺组织中AQPl的mRNA表达水平与α-ENaC的m R N A表达行相关性分析,提示两者呈正相关关系,直线等级相关系数为0.451(p<0.01)。
　　(2)在实验第3天时,Ⅱ组(高氧组)肺组织中SP-A的mRNA表达水平较I组(空气组)明显升高(P<0.05),在实验第7天、14天时Ⅱ组(高氧组)肺组织中SP-A的mRNA表达水平较I组(空气组)明显下降(P　　结论:1.暴露于高氧中可致新生大鼠发生肺损伤,并随暴露时间的延长肺损伤渐加重。主要病理表现为肺组织水肿、结构紊乱、肺泡内出血、炎性细胞浸润,肺泡数目减少,肺泡间隔增厚及纤维化等。
　　2.高氧性肺损伤时,AQPl及 a-ENaC的蛋白及mRNA的表达水平较正常对照组中相应蛋白及mRNA的表达水平下降,与肺水肿的程度相一致,提示AQPl、α-ENaC的蛋白及mRNA的表达水平的变化在急性高氧性肺损伤的肺水肿的形成中起着重要作用。
　　3.高氧性肺损伤时,SP-A蛋白及m RNA表达水平呈先增高后降低的趋势,与肺损伤的程度相平行,提示肺表面活性物质相关蛋白分泌减少是高氧肺损伤的重要因素。
　　4.雾化吸入呋塞米可能通过抑制钠钾氯共同通道、舒张血管、减轻炎症反应等作用,进而上调AQP1、α-ENaC、SP-A的蛋白表达水平及m RNA表达水平,改善肺功能,从而对高氧性肺损伤起到一定保护作用。

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英文摘要

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前言

材料与方法

—、实验试剂及仪器

二、实验步骤和方法：

三、统计学处理

结果

一、实验动物一般情况

二、肺组织病理学改变

三、肺组织湿/干重比（W/D)

四、支气管肺泡灌洗液（BLAF) 中总蛋白含量测定

五、肺组织中A Q P l、a-ENaC、SP-A蛋白表达水平变化

六、肺组织中A Q P l、Oi-ENaC、SP-AmRNA表达水平变化

讨论

一、高氧致BPD动物模型的理论基础

二、水通道蛋白（A Q P l )、钠通道（a-ENaC) 的结构与功能以及在高氧性肺损伤中的表达

三、肺表面活性物质相关蛋白的结构与功能以及在髙氧性肺损伤中的表达

四、呋塞米雾化对急性髙氧性肺损伤模型中肺组织的保护作用

结论

参考文献

附录

综述一：支气管肺发育不良的发病机制及诊治进展

综述二：钠通道蛋白、水通道蛋白及肺表面活性物质相关蛋白与肺损伤的研究

英汉双解缩略词表

致谢