新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后海马神经细胞自噬检测及雷帕霉素对预后的干预

摘要

目的:研究新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(Hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)后海马组织中神经元细胞的损伤情况,通过观察不同时间点及各组间细胞死亡、自噬相关蛋白的表达,初步探讨雷帕霉素对HIBD后神经元存活的干预作用。
　　方法:采用7日龄新生SD(Sprague Dawley)大鼠,根据改良Rice-Vannucci法建立HIBD模型。将新生大鼠随机分为雷帕霉素干预组(Ra组)、缺氧缺血组(HIBD组)及假手术组(Sham组)。选取HIBD模型制成后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h及72h六个时间点,通过Western blot法测定海马组织中Cleaved caspase-3、Beclin-1、LC3蛋白浓度的变化;采用免疫组织化学法染色观察海马组织Cleaved caspase-3染色情况,结合HE染色及尼氏染色从细胞层面了解海马区域神经细胞发生缺氧缺血损伤后的转归情况,并探讨应用自噬激动剂雷帕霉素对其发挥的干预作用及可能机制。
　　结果:
　　1、HE染色结果:
　　1.1 Sham组脑组织海马区域6个时间点HE染色后光镜下观察:海马区域组织染色均匀、结构清晰,神经细胞形态正常,胞质染色为淡红色,胞核染色为蓝色;
　　1.2 HIBD组脑组织HE染色后光镜下观察:缺氧缺血侧海马神经细胞变性及坏死的程度随时间的延长而加重,表现为海马区域组织结构紊乱、间质水肿,神经细胞肿胀甚至坏死,胞核出现深染、固缩、碎裂,核仁消失,伴有不同程度的炎性细胞浸润;
　　1.3 Ra组脑组织HE染色后光镜下观察:缺氧缺血侧海马神经细胞出现变性及部分神经细胞坏死,但程度及范围均较HIBD组轻;
　　2、Western-blot结果:
　　2.1 Beclin-1蛋白:与Sham组相比,HIBD组该蛋白自0h起表达迅速升高,至24h达高峰,且每个时间点表达均显著高于Sham组(P<0.05);与HIBD组相比,Ra组该蛋白表达趋势与HIBD组一致,且每个时间点表达均高于HIBD组,且具有统计学意义(P<0.05);
　　2.2 LC3II:与Sham组相比,HIBD组及Ra组的该蛋白表达在6个时间点的表达均高于Sham组,且具有统计学意义(P<0.05);HIBD组及Ra组该蛋白均从0h起开始上升,且Ra组的表达在每个时间点均高于HIBD组,除外12h这一时间点外,其它5个时间点均有统计学意义(P<0.05);
　　2.3 Cleaved caspase-3蛋白:与Sham组相比,HIBD组及Ra组该蛋白的表达除0h无明显增加外,其余5个时间点均显著升高,且具有统计学意义(P<0.05);与HIBD组相比,Ra组该蛋白表达在每个时间点均低于HIBD组,但只有6h及12h具有统计学意义(P<0.05);
　　3、Cleaved caspase-3蛋白免疫组织化学染色结果:
　　Sham组海马区域各个时间点染色均较浅;与HIBD组相比,Ra组染色仅在6h及12h浅于HIBD组,且平均光密度值具有统计学意义(P<0.05),其余时间点两组无显著差异(P>0.05);
　　4、尼氏染色结果:
　　与Sham组相比,HIBD组及Ra组每个时间点均存在不同程度的海马区域结构紊乱、神经细胞数量减少、细胞核碎裂、溶解及尼氏小体崩解及丢失,随时间延长而加重;根据尼氏染色计数神经细胞丢失数目,与HIBD组相比,Ra组均少于HIBD组,随时间延长结果差异性越显著,以48h及72h最明显,具有统计学意义(P<0.05);
　　结论:
　　1、HIBD后海马组织区域神经细胞出现细胞损伤,表现为核溶解及碎裂,部分细胞分界模糊,并且牵涉到凋亡、自噬及坏死三种形式;
　　2、在本实验中提前腹腔注射雷帕霉素,在HIBD早期能够抑制海马区神经细胞发生凋亡,保护细胞质膜完整性,减轻炎症反应;
　　3、适度激活自噬对新生大鼠发生HIBD后对海马区神经细胞具有一定保护作用。

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前言

1.1缺氧缺血性脑病概况

1.2自噬参与HIBD后脑组织的损伤修复

1.3自噬激动剂--雷帕霉素对自噬的调节作用

材料与方法

1.实验动物及主要材料

2.实验方法及步骤

3.数据处理及统计分析

结果

1. 模型建立情况观察

2. 海马组织中自噬相关蛋白Beclin-1含量的变化

3. 海马组织中自噬相关蛋白LC3II含量的变化

4. 海马组织中凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3含量的变化

5. 海马组织Cleaved caspase-3免疫组化结果

6. 尼氏染色结果

讨论

1、自噬的发生

2、雷帕霉素对自噬产生的激活效应

3、雷帕霉素对神经元预后的干预作用

结论

参考文献

综述

英汉缩略语名词对照

研究生期间发表及待发表文章

本课题资助项目

致谢