锶对磨损颗粒诱导炎性骨溶解抑制作用的实验研究

摘要

本文从以下几部分进行了论述。
　　第一部分:锶离子在钛颗粒诱导破骨细胞活化中的作用
　　目的：观察锶离子(strontium,Sr2+)对钛颗粒(titanium particles,Ti)诱导破骨细胞活化的影响。
　　方法：选用小鼠单核/巨噬细胞系RAW264.7细胞作为研究对象,采用核因子(NF-κB)受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factorкB ligand,RANKL RANKL;70ng/ml)和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage-colony stimulating factor,M-CSF;30ng/ml)诱导RAW264.7向破骨细胞分化。实验分为5组:仅RAW264.7细胞,为空白组;RAW264.7+Ti,为Ti组;RAW264.7+RANKL+M-CSF,为R组;RAW264.7+RANKL+M-CSF+Ti,为R+Ti组;在R+Ti组的基础上加入不同浓度Sr2+(0.5、1、2、5、10mmol/L),为Sr2+组。采用细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8)检测检测0.1g/L Ti和不同浓度Sr2+处理RAW264.7细胞24、48、72h后的细胞增殖活性;应用抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色检测各组中破骨细胞(细胞核≧3)数目;采用骨细胞培养表面(OAS)板检测破骨细胞骨吸收能力;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测组织蛋白酶K(cathepsin K,Cath-K)、TRAP、金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase9,MMP-9)、降钙素受体(calcitonin receptor,CTR)基因mRNA的表达。
　　结果：CCK-8检测结果表明,0.1g/L Ti颗粒和不同浓度Sr2+(0.5、1、2、5、10mmol/L)对RAW264.7细胞增殖能力无明显影响(P>0.05)。TRAP染色,R组、R+Ti组均可见大量的紫红色多核细胞,Ti组和Sr2+组多核细胞较少,空白组未见多核细胞;Sr2+≥5mmol/L时,TRAP阳性细胞数量[(323.33±43.84)、(146.67±33.99)]个/孔,与R组[(453.33±33.99)个/孔]比较,差异有统计学意义(P<0.05)。OAS板检测结果,5mmol/LSr2+组骨吸收陷窝面积比(6.53±2.02)％,与R+Ti组[(47.24±5.03)％]比较,差异有统计学意义(P<0.05)。定量RT-PCR结果,Sr2+组Cath-K、TRAP、MMP-9和CTRmRNA相对表达量分别为2.76±0.66、2.69±0.57、2.10±0.34和1.72±0.32,与R+Ti组比较(7.97±0.77、10.10±1.18、7.37±1.02和5.55±0.53),表达量明显降低(P<0.05)。
　　结论：Sr2+能够抑制Ti诱导的破骨细胞的生成,抑制Ti诱导的破骨细胞表型基因Cath-K、TRAP、MMP-9和CTR mRNA的表达,减轻Ti活化的破骨细胞性骨吸收,提示Sr2+能够抑制Ti颗粒诱导的破骨细胞活化。
　　第二部分:锶离子抑制钛颗粒诱导破骨细胞活化作用的机制研究
　　目的：探讨锶离子(Sr2+)在抑制钛颗粒诱导破骨细胞活化过程中,对细胞核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信号途径及炎性因子表达的影响。
　　方法：选用小鼠单核/巨噬细胞系RAW264.7细胞作为研究对象。实验分为3组:仅RAW264.7细胞,为空白组;RAW264.7+Ti,为Ti组;RAW264.7+Ti+5mmol/L Sr2+,为Ti+Sr2+组。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测c-fos和激活T细胞的核因子c1(nuclear factor of activated T-cells c1,NFATc1)基因mRNA的表达。蛋白免疫印迹法(Western blot)检测κB抑制蛋白α(inhibitoryκBα,IκBα)蛋白表达水平;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测炎性因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、(interleukin-1β,IL-1β)及(interleukin-6,IL-6)表达水平。
　　结果：Western blot结果表明,Ti(0.1g/L)加入后15min,IκBα表达水平明显降低,60min降至最低,180min后IκBα又恢复到基准水平。以5mmol/L Sr2+预处理120min,再加入Ti颗粒处理15、30和60min,IκBα表达水平变化不明显。RT-PCR结果提示,Ti加入后1h,NFATc1表达量达到最高水平,3h开始降低,6h降低基准水平; Ti加入1h后,c-fos表达量明显增高,3h达到最高水平,6h表达量降低,但仍高于基准值。Sr2+预处理细胞120min,再与Ti共培养6h,两基因表达量与Ti组比较均明显降低。ELISA检测结果显示,共培养48h后,空白组上清液中TNF-α,IL-1β和IL-6分别为(54.8±7.3)pg/ml、(113.6±9.6)pg/ml和(41.6±7.0)pg/ml, Ti+Sr2+组[(153.0±14.3)、(203.2±13.5)、(101.4±9.1)],与Ti组[(309.6±20.0)、(257.6±14.3)、(164.4±13.1)] pg/ml比较,差异有统计学意义(P<0.05)。
　　结论：Sr2+通过干扰NF-κB信号途径和降低炎性因子TNF-α,IL-1β和IL-6表达水平,抑制Ti颗粒诱导的破骨细胞活化。
　　第三部分:雷尼酸锶抑制钛颗粒诱导炎性骨溶解的实验研究
　　目的：观察雷尼酸锶(strontium ranelate,SR)在钛颗粒(Ti)诱导炎性骨溶解中的作用。
　　方法：60只雄性,8-10周龄,C57BL/J6小鼠,随机分为空白组、SR组、Ti组、和Ti+SR组,每组15只。采用Ti诱导的小鼠颅骨骨溶解模型,Ti+SR组建模当日予SR(900mg/kg/d)灌胃,持续至建模后14天,处死小鼠取材。微计算机断层扫描技术(Micro-CT)分析颅骨骨密度及骨量变化;HE染色观察颅骨骨溶解程度;抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色检测颅骨中成熟破骨细胞数目;免疫组织化学染色(IHS)检测核因子受体活化因子(receptor activators of nuclear factor-kappa B,RANK)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测骨保护素(osteoprotegerin,OPG)、核因子受体活化因子受体(RANKL)、TNF-α和白介素-1β(IL-1β)表达水平。
　　结果：Micro-CT3D分析结果提示,Ti组颅骨骨陷窝范围广,深度大,Ti+SR组颅骨骨陷窝量明显下降,空白组颅骨骨密度(bone minaral density,BMD)、骨体积(bone volume,BV)和骨体积/组织体积(bone volume/tissue volume,BV/TV)分别为(0.77±0.02)mg/mm2、(1.55±0.03)mm3和(23.12±0.93),Ti+SR组为[(0.73±0.03) mg/mm2、(1.50±0.03)mm3、(21.97±0.55)％],与Ti组[(0.62±0.03)mg/mm2、(1.22±0.07)mm3、(16.05±0.63)％]比较,差异有统计学意义(P<0.05); HE染色结果显示,空白组及SR组未见明显骨溶解,Ti组颅骨溶解区域广、深度大,Ti+SR组骨溶解程度明显减轻,Ti+SR组颅骨面积比(87.67±4.63)％,与Ti组[(56.83±7.19)％]比较,差异有统计学意义(P<0.05);TRAP染色结果,空白组及SR组可见点状的紫红色阳性改变,且主要集中于髓腔边缘;Ti组颅骨溶解侧可见大片紫红色区域,表明颅骨溶解侧有大量的破骨细胞存在,Ti+SR组仅在在颅骨溶解边缘有少量阳性区域;IHS染色结果,Ti组RANK和TNF-α棕黄色阳性区域,与空白组比较明显增多, SR干预后阳性区域明显降低;ELISA检测结果显示,空白组颅骨培养上清液中OPG、RANKL、TNF-α和IL-1β的含量分别为(2144±81)pg/ml、(11.8±0.8)pg/ml、(101.2±7.3)pg/ml和(97.0±9.9)pg/ml,Ti+SR组为[(2050±42)、(13.0±1.0)、(145.6±14.2)和(130.2±8.2)]pg/ml,与Ti组[(1636±61)、(19.6±1.8)、(210.2±8.9)和(159.6±9.7)]pg/ml比较,差异有统计学意义(P<0.05)。
　　结论：SR通过调节RANKL/RANK/OPG系统,同时降低炎性因子TNF-α和IL-1β的表达,抑制破骨细胞的生成,减轻Ti诱导的炎性骨溶解。因此,以锶为基础研制的药物有望成为预防和治疗磨损颗粒引起的假体无菌性松动(aseptic loosening,AL)的新选择。

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前言

第一部分：锶离子在钛颗粒诱导破骨细胞活化中的作用

材料与方法

结果

讨论

第二部分：锶离子抑制钛颗粒诱导破骨细胞活化的作用机制

材料与方法

结果

讨论

第三部分：雷尼酸锶抑制钛颗粒诱导炎性骨溶解的实验研究

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述

中英文缩略词

攻读学位期间公开发表的论文

本研究所获的基金资助

致谢