RGD修饰、AFP启动子介导的E1A和IL-24双基因腺病毒载体用于肝癌基因治疗的研究

摘要

目的:
　　构建RGD修饰,AFP启动子介导的E1A和IL-24双基因共表达腺病毒载体(Ad.RGD-AFP-E1A-IL-24),研究其感染效率及对肝癌的选择性抑瘤增效效应与分子机制。
　　方法:
　　在本科室已成功构建pAdTrack-CMV-E1A-PolyA-promoter-IL24、pAdTrack-CMV-PolyA-promoter转移质粒的基础上,在多克隆酶切位点的XbaⅠ、HindⅢ酶切位点间插入hAFP片段,构建pAdTrack-AFP-E1A-polyA-promoter-IL-24重组转移载体,与RGD-4C修饰的腺病毒骨架质粒pAd.RGD经同源重组、包装和扩增获得Ad.RGD-AFP-E1A-IL-24双基因共表达重组腺病毒。体外检测对比未经修饰的重组腺病毒与RGD修饰的重组腺病毒对多种细胞的感染复数,MTT法和FCM对比检测不同感染复数下RGD修饰与未经RGD修饰的重组腺病毒对多种细胞的增殖影响和在同一感染复数下对不同细胞诱导凋亡的效果。对比Ad.RGD-AFP-E1A-IL-24与Ad.RGD-CMV-E1A-IL-24重组腺病毒在不同细胞中的复制能力,通过 MTT和 FCM验证其对不同细胞增殖影响及诱导细胞凋亡的靶向性。将Ad.RGD-AFP-E1A-IL-24体外感染HepG2肝癌细胞,RT-PCR和Western blot检测目的基因E1A和IL-24在细胞中的表达,MTT法和FCM检测其体外抑制神肝癌细胞生长和诱导凋亡的增效效应, RT-PCR法检测细胞周期和凋亡相关基因Bax、Bcl-2、p53、p21和survivin的表达, Western blot检测凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3的表达。
　　结果:
　　成功构建了RGD-4C修饰、AFP启动子介导的E1A和IL-24双基因共表达腺病毒载体 Ad.RGD-AFP-E1A-IL-24。与未经修饰的腺病毒比较,RGD明显提高了腺病毒对细胞的感染能力,使腺病毒在相同的感染复数下对细胞增殖的抑制能力以及诱导细胞凋亡的能力显著增强。以AFP为启动子的Ad.RGD-AFP-E1A-IL-24相比Ad.RGD-CMV-E1A-IL-24重组腺病毒,具有在肝癌细胞中选择性复制的能力,以及对肝癌细胞具选择性生长抑制和诱导凋亡,具备了针对肝癌细胞的靶向性。双基因重组腺病毒Ad.RGD-AFP-E1A-IL-24能明显抑制HepG2肝癌细胞的生长、诱导凋亡。分子机制检测结果表明:Ad.RGD-AFP-E1A-IL-24能明显上调HepG2细胞p53、p21、Bax、Cleaved Caspase-3和下调Bcl-2、Survivin等细胞周期和凋亡相关表达因子;且其效应较Ad.RGD-AFP-E1A、Ad.RGD-AFP-IL-24单基因重组腺病毒更为显著。
　　结论:
　　1、成功构建了RGD修饰、AFP启动子介导的E1A和IL-24双基因共表达腺病毒载体Ad.RGD-AFP-E1A-IL-24。
　　2、RGD修饰的腺病毒载体对细胞具有更好的感染能力,更强的抑制细胞增殖能力及诱导细胞凋亡能力。
　　3、AFP为启动子的腺病毒具备了在肝癌细胞中选择性增殖、抑制肝癌细胞生长、诱导细胞凋亡的靶向杀伤能力。
　　4、Ad.RGD-AFP-E1A-IL-24双基因表达更显著抑制HepG2细胞生长和诱导凋亡,双基因呈现出叠加的抑瘤增效作用。
　　5、Ad.RGD-AFP-E1A-IL-24双基因表达更具显著上调p53、p21、Bax、Cleaved Caspase-3和下调Bcl-2、Survivin等细胞周期和凋亡相关表达因子,这可能是其双基因表达对肝癌细胞生长抑制具有叠加抑瘤增效作用的重要机制之一。

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引言

第一部分 Ad.RGD-AFP-E1A-IL24双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

参考文献

第二部分 RGD修饰的重组腺病毒与无RGD修饰的重组腺病毒的比较

1 材料和方法

2 实验结果

3 讨论

参考文献

第三部分 Ad.RGD-AFP-E1A-IL-24对肝癌细胞的靶向性研究

1 材料和方法

2 实验结果

3 讨论

参考文献

第四部分 单双基因重组腺病毒对肝癌细胞生长抑制效应的体外实验研究

1 材料和方法

2 实验结果

3 讨论

参考文献

综述：整合素蛋白受体和RGD在肿瘤的基因治疗中的应用

发表和待发表的论文

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