基于转录组测序的中华鳖微卫星标记的开发及MSTN基因的克隆表达

摘要

中华鳖(Pelodiscus Sinensis),隶属于爬行纲(Reptilia)、龟鳖目(Testudinata)、鳖科(Trionychidae)、鳖属(Pelodiscus),其肉质鲜嫩、风味鲜美独特,自古以来就是深受消费者喜爱的滋补珍品。近年来随着生活水平的提高,中华鳖的消费量呈逐年上升趋势,其养殖规模也逐年扩大。然而自上世纪九十年代以来,由于大量境外走私鳖涌入我国,加之各养殖场间相互引种、和近亲繁殖,导致中华鳖的种质性状出现退化,严重影响了中华鳖产业的可持续发展,因此种质保护和良种选育是中华鳖养殖产业亟待解决的重要课题。为此本文采用转录组测序技术,开发了与生长性状相关的中华鳖EST-SSR标记,分析了与经济性状关联的基因位点,并对中华鳖四个不同养殖群体的遗传结构和遗传多样性进行了分析;开展了中华鳖MSTN(Myostatin)基因的克隆及表达分析,为寻找挖掘中华鳖生长性状相关基因的分子结构和功能,及其遗传育种等工作奠定了一定的科学基础。主要研究结果如下：
　　⑴基于中华鳖转录组测序的EST-SSR标记的开发、验证。根据中华鳖转录组测序获得的文库序列,通过MSATCOMMANDER来检索全部非冗余unigenes中的SSR位点,并通过PRIMER3软件来设计PCR引物,再根据基因注释及 GO二级分类的结果,挑选分类中生长(growth progress)、增殖(reproduction progress)、代谢(metabolism progress)三个 GO二级分类条目中isogene上的SSR位点所设计的100对引物,进行多态性的验证,从中筛选得到了15对多态性引物,对太湖鳖、日本鳖、黄河鳖、淮河鳖4个中华鳖养殖群体进行基因扫描、种群遗传结构分析和多样性检测。统计各个微卫星位点的等位基因频率(P)、等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、哈德温伯格平衡PHW、多态性信息含量PIC。同时,采用MEGA3.2软件绘制基于Nei氏标准遗传距离的UPGMA系统进化树。分析统计结果如下：①中华鳖转录组测序组装和拼接后共得到85246条unigenes,其中在15319个(17.97％)unigenes中共检索到19452个SSR位点,微卫星分布的频率和密度分别是22.82％和177 per Mb,共有11801个位点(61％)被成功设计获得引物,从三个GO二级分类条目上的isogene上的SSR位点中随机筛选设计的100对引物,经过验证,23对表现为多态性。②15对引物对四个中华鳖群体120只个体进行基因扫描共得到354个等位基因,每个位点得到的等位基因数从2至7个不等,平均等位基因数为2.95,平均有效等位基因数为2.46;平均观测杂合度为0.40,平均期望杂合度为0.55,平均多态性信息含量为0.48,达到中度多态水平(0.5>P>0.25)。③黄河鳖与日本鳖之间遗传距离最大(0.157),遗传相似系数最小(0.8547),说明两者亲缘关系较远;黄河群体与淮河群体遗传距离最小(0.0841),遗传相似系数最大(0.9194),说明两者亲缘关系较近。聚类分析结果表明:黄河鳖和淮河鳖先聚为一支,然后与太湖鳖聚合,最后才与日本鳖聚合。
　　⑵中华鳖EST-SSR标记与生长性状关联性分析。采用中华鳖转录组测序开发的15对多态性EST-SSR引物,对60只中华鳖的体长、体重、背甲长和裙边宽4种生长性状进行标记-性状相关性研究,结果表明:C8387位点分别与体长、体重、背甲长和裙边宽显著相关(P<0.05)和极显著相关(P<0.01),CC型、AB型分别为4种性状的优势、劣势基因型;C211位点分别与体重、背甲长和裙边宽呈极显著相关(P<0.01)和显著相关(P<0.05),其中等位基因C与体重呈负相关,CC型是裙边宽、背甲长性状的劣势基因型,而BB型和AB型分别是裙边宽和体重的优势基因型;C5670位点与体重和背甲长分别呈极显著相关(P<0.01)和显著相关(P<0.05),其中BB型和AA型分别是体重和背甲长的优势、劣势基因型;C1312和 C13038位点均与体重、背甲长极显著相关(P<0.01),且C1312上的BC型、C13038上的BB型分别是中华鳖体重、背甲长性状的优势基因型。
　　⑶中华鳖MSTN基因的克隆及表达分析。根据中华鳖转录组测序获得的部分MSTN cDNA片段设计引物,对其5’端和3’端分别进行RACE(cDNA末端快速克隆),获得MSTN的cDNA全长,并对其进行生物信息学分析,还利用RT-PCR技术研究了MSTN基因在中华鳖不同年龄、不同组织中的表达情况,结果表明：①中华鳖 MSTN基因的cDNA全长为2301bp,包含69bp的5’非编码区(5’-UTR)、1128bp的开放阅读框,共编码375个氨基酸、1084bp的3’非编码区(3’-UTR),且3’-UTR具有明显的终止密码子 TGA、加尾信号 AATAAA及多聚 A尾巴;其中C端生物活性区含有9个保守的半胱氨酸残基;RSRR为蛋白水解加工位点;中华鳖MSTN基因编码的蛋白属于跨膜蛋白,蛋白上存在一个分泌信号肽结构,该蛋白由6个α-螺旋和16个β-折叠片组成,三维同源建模的结果符合TGF-β超家族的特征。中华鳖MSTN cDNA序列经过氨基酸序列比对,与西部锦龟(Chrysemys picta bellii)、绿海龟(Chelonia mydas)、火鸡(Meleagris gallopavo)、鸡(Gallus gallus)、绿头鸭(Anas platyrhynchos)、人(Homo sapiens)、短尾等的相似度达到了80％~99％。②MSTN在中华鳖每个组织中都有一定量的表达,其相对表达量的高低依次为:大腿肌>心肌>肝脏>脑>肾脏>脾脏,其中在大腿肌中MSTN的表达量相对强度值为0.6064,且显著高于其他5种组织(P<0.05),而心肌和肝脏其次,分别为0.146和0.1196,而肾脏和脾脏中的表达量相对值最低,仅为0.0346和0.0289;除了大腿肌和心肌之外,其他5种组织之间差异不显著(P>0.05)。③MSTN基因在中华鳖各个年龄段都有表达,且随着年龄增长呈先升高再降低的趋势,其中3龄中华鳖MSTN表达水平相对最高,表达强度为0.2635;其次是1龄鳖和2龄鳖,相对表达量分别为0.1403,0.1819,4龄中华鳖的表达强度最低仅为0.0844;其中3龄与4龄中华鳖 MSTN表达水平达到了显著性的差异(P<0.05)。

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引言

文献综述

试验一 基于中华鳖转录组测序的微卫星标记的开发、验证

1材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

试验二 中华鳖EST-SSR标记与生长性状相关性分析

1材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4小结

试验三 中华鳖MSTN基因 的克隆及表达分析

1材料与方法

2. 结果与分析

3.讨论

4小结

结论

参考文献

攻读学位期间公开发表的论文

致谢