心肌细胞-巨噬细胞内质网应激传递及其在CVB3感染诱导的病毒性心肌炎中的作用

摘要

内质网（endoplasmic reticulum，ER）是真核细胞内蛋白质折叠、修饰、组装的场所。当蛋白发生不正确的加工或修饰时，ER起到一个质量控制的作用，将那些非折叠或错折叠蛋白滞留在ER然后清除。一旦聚集在ER内的未折叠或错误折叠蛋白超过ER的负荷能力，将会引起ER平衡失调，从而导致ER应激(endoplasmicreticulum stress，ER stress)。早期的ER stress通过激活非折叠蛋白反应(unfoldedprotein response，UPR)减轻ER内压力，而长期、严重的ER stress则导致细胞凋亡或死亡。多种因素如缺血缺氧、钙离子失衡、糖耗竭、蛋白糖基化障碍或二硫键形成异常等均可使内质网内稳态失衡，引起内质网应激，激活未折叠蛋白反应。内质网应激与机体多种疾病的发生密切相关，现在研究较多的主要有神经系统性疾病、糖尿病、动脉粥样硬化以及病毒感染等疾病。
　　柯萨奇B3型病毒(coxsackievirus B3 type，CVB3)是病毒性心肌炎(VMC)最常见的病原体，它属于细小RNA病毒科肠道病毒属，其感染与急、慢性心肌炎和扩张性心脏病关系紧密。近年来我国病毒性心肌炎发病呈上升趋势，而其发病机制尚不清楚。越来越多的证据表明除病毒直接破坏作用之外，病毒性心肌炎心肌细胞损伤还与局部炎性细胞的浸润有关，巨噬细胞作为主要的炎性浸润细胞而被我们关注。有文献提示，ER stress可以通过参与调控巨噬细胞的功能来影响疾病的发展。我们猜想CVB3感染过程中，ER stress会不会通过影响巨噬细胞的功能来调控疾病的发展。
　　在本研究中我们使用CVB3感染6-8周雄性BALB/c小鼠，分别检测正常小鼠和发病小鼠心肌细胞及心脏中浸润的巨噬细胞ER stress水平，我们发现CVB3感染后病毒性心肌炎小鼠心肌细胞和心脏中浸润巨噬细胞都能检测到明显的ERstress。但是当我们在体外用CVB3作用于RAW264.7细胞和骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)时却检测不到ER stress，而乳鼠心肌细胞在体外用CVB3感染后能检测到明显的ER stress。有文献报导处于ER stress状态的肿瘤细胞可以通过释放某种或某些可溶性因子将ER stress传递给巨噬细胞，我们猜想小鼠心脏浸润的巨噬细胞的ER stress不是CVB3直接作用产生的，而是来自于具有ER stress的心肌细胞的传递。通过在体外建立了ER stress传递体系，我们发现心肌细胞可以将ER stress传递给巨噬细胞。并且我们进一步通过体内外验证巨噬细胞ER stress在CVB3感染诱导的病毒性心肌炎小鼠发病中发挥重要作用。具体分为以下几个部分:
　　一、CVB3感染诱导的病毒性心肌炎小鼠ER stress水平检测
　　1)分离纯化正常小鼠和CVB3感染不同时间段病毒性心肌炎小鼠心肌细胞后检测小鼠心肌细胞ER stress情况我们发现:雄性BALB/c小鼠感染CVB3后心肌细胞从第一天开始就出现ER stress，并且到第三天达到高峰，随后又略微下降。
　　2)流式分选出CVB3感染不同时间段心脏浸润的巨噬细胞我们发现:CVB3感染后小鼠心脏中浸润的巨噬细胞从第三天开始出现ER stress，并且从第三天到第七天ER stress水平呈递增趋势。
　　二、CVB3不能诱导巨噬细胞内质网应激但心肌细胞内质网应激可以传递给巨噬细胞
　　1.首先我们在体外用CVB3(MOI=10)感染RAW264.7细胞和骨髓来源的巨噬细胞，分别作用0h、6h、12h、24h，我们发现:
　　1) CVB3不能直接诱导巨噬细胞系RAW264.7细胞发生ER stress
　　2) CVB3不能直接诱导原代的骨髓来源的巨噬细胞ER stress的产生。
　　2.我们又分别用(MOI=100) CVB3感染乳鼠心肌细胞和(MOI=1) CVB3感染Hela细胞，结果发现:
　　1) CVB3感染乳鼠心肌细胞12小时与对照组相比有明显的ER stress应答发生。
　　2) CVB3感染Hela细胞12小时后也能检测到明显的ER stress应答。
　　3.我们猜想心脏浸润巨噬细胞的ER stress是从心肌细胞传递过来的，接下来我们分离培养CVB3感染的成年雄性BALB/c小鼠心肌细胞，收集细胞培养上清用于培养RAW264.7细胞，对照组用正常小鼠分离培养的心肌细胞培养上清进行培养，检测RAW264.7细胞ER stress。结果我们发现:
　　1) CVB3感染小鼠分离的心肌细胞培养上清培养的RAW264.7细胞检测到明显的ER stress。也就是说CVB3感染后的心肌细胞分泌了某种可溶性因子作用于巨噬细胞，使巨噬细胞发生ER stress。
　　2)然后我们分别收集CVB3感染雄性小鼠心肌细胞体外培养6h、12h、24h的培养上清用于培养RAW264.7细胞，然后检测巨噬细胞系中ER stress情况，我们发现，巨噬细胞的ER stress与心肌细胞分泌的因子呈剂量依赖性。
　　三、传递性巨噬细胞内质网应激在CVB3感染诱导的病毒性心肌炎中的作用
　　1.体外实验验证巨噬细胞ER stress在CVB3感染过程中的作用
　　首先，我们将CVB3感染诱导的病毒性心肌炎小鼠心脏中浸润的巨噬细胞分离出来在体外进行培养，在培养基中加入500μg/ml ER stress抑制剂-牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)培养12小时后收集培养上清，我们发现随着心脏中浸润的巨噬细胞ER stress被抑制，培养上清中巨噬细胞分泌的炎性细胞因子IL-6水平明显下降。
　　接着，我们培养巨噬细胞系RAW264.7细胞，在用CVB3感染的同时，其中一组用衣霉素(Tm)上调ER stress，另一组加等量的DMSO作为对照，同样检测炎症因子的分泌情况，我们也发现随着巨噬细胞ER stress被上调，巨噬细胞分泌的炎性因子IL-6水平明显上调。说明ER stress能促进巨噬细胞炎性因子IL-6的分泌。
　　2.体内实验进一步验证巨噬细胞ER stress在CVB3感染诱导的病毒性心肌炎中的作用
　　我们首先用氯磷酸盐清除小鼠体内的巨噬细胞，再给小鼠腹腔感染103 TCID50剂量的CVB3，在感染的第三天分别将诱导ER stress的骨髓来源的巨噬细胞和预先抑制ER stress的巨噬细胞通过尾静脉转输到小鼠体内，每只小鼠转输5×106个细胞。我们发现:
　　1) CVB3感染第三天小鼠转输不同巨噬细胞后取感染后7天的小鼠心脏，观察心肌病理学改变，结果显示:转输预先诱导ER stress巨噬细胞组小鼠心脏病灶炎性浸润最严重，而转输ER stress被抑制和未转输组心肌病理改变轻微。提示我们巨噬细胞ER stress促进心肌炎病程发展。
　　2)以体重减轻率衡量小鼠发病情况，转输预先诱导ER stress巨噬细胞的小鼠在转输后第1天体重就有明显下降，转输ER stress被抑制的巨噬细胞和未转输组小鼠感染后体重改变轻微。
　　3)以血清学指标来衡量小鼠心肌损伤程度:转输ER stress被抑制的巨噬细胞和未转输组的小鼠的CK和CK-MB显著低于转输诱导了ER stress巨噬细胞组小鼠。
　　4)小动物超声成像结果动态展示了小鼠心脏收缩功能，从结果分析我们看到，转输诱导ER stress巨噬细胞的小鼠在转输后心脏左室射血分数(LVEF％)和左室短轴缩短率(LVFS％)明显低于转输ER stress被抑制巨噬细胞组和未转输组，说明转输诱导了ER stress巨噬细胞的小鼠心脏功能受损严重。
　　以上结果提示我们CVB3感染后心脏内心肌细胞首先发生ER stress，并且通过释放某些可溶性因子诱导心脏内浸润的巨噬细胞也发生ER stress，发生ER stress的巨噬细胞参与了病毒性心肌炎的发生发展。
　　综上所述，本研究首次发现在CVB3感染引起的病毒性心肌炎小鼠心肌细胞和心脏浸润巨噬细胞内存在ER Stress，同时我们还发现ER stress在心肌细胞和巨噬细胞之间的传递。并且我们通过体内外实验在一定程度上阐明了巨噬细胞ERstress在CVB3感染引起的病毒性心肌炎中的作用，从而进一步阐明了病毒性心肌炎的发病机制，为病毒性心肌炎的治疗提供新的思路。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 CVB3感染诱导的病毒性心肌炎中存在内质网应激

材料与方法

结果

讨论

第二部分 CVB3不能诱导巨噬细胞内质网应激但心肌细胞内质网应激可以传递给巨噬细胞

材料与方法

结果

讨论

第三部分 传递性巨噬细胞内质网应激在CVB3感染诱导的病毒性心肌炎中的作用

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

综述：内质网应激和固有免疫应答

附录

攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文

致谢