尿酸调节Nrf2信号通路减轻6-OHDA对SH-SY5Y细胞损伤的实验研究

摘要

第一部分尿酸增加谷胱甘肽合成减轻6-OHDA对SH-SY5Y细胞损伤作用
　　目的:探讨尿酸(uric acid, UA)对6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的SH-SY5Y细胞损伤发挥保护作用的机制。
　　方法:采用6-OHDA制作SH-SY5Y细胞损伤的帕金森病细胞模型,分为对照(DMEM)组、6-OHDA(50μmol/L)组、尿酸组(200μmol/L)以及6-OHDA(50μmol/L)+尿酸组(200μmol/L)。预给尿酸0.5h后6-OHDA作用6h、12h、14h、18h、24h后MTT比色法检测细胞活性;作用12h倒置显微镜下观测细胞形态;比色法检测谷胱甘肽含量;预给尿酸0.5h后6-OHDA作用12h后Western blot和RT-PCR法分别测定γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基(γ-GCLC)和γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶调节亚基(γ-GCLM)蛋白和mRNA水平的表达量。
　　结果:200μmol/L尿酸对50μmol/L6-OHDA作用12h、14h、18h、24h的SH-SY5Y细胞活性下降有显著的改善(78.10±2.36％vs57.44±12.02％,80.52±3.16％vs50.15±2.32％,70.82±1.81％vs39.22±0.78％,42.84±4.73％vs27.99±4.23％,P<0.01, P<0.001, P<0.001,P<0.001);作用12h后尿酸处理组细胞形态明显改善;谷胱甘肽含量下降有显著的改善(9.51±0.37μmol/L vs3.88±0.78μmol/L, P<0.01);200μmol/L尿酸+50μmol/L6-OHDA组与50μmol/L6-OHDA组相比,γ-GCLC蛋白表达水平显著升高(139.85±11.62％vs49.20±7.09％,P<0.01);γ-GCLM.表达水平明显下降(95.36±18.98％vs160.05±8.59％,P<0.05)。mRNA水平上γ-GCLC转录水平显著升高(110.99±14.41％vs49.19±6.87％,P<0.001);γ-GCLM.转录水平明显下降(102.70±10.43％vs190.05±8.59％,P<0.05)。
　　结论:尿酸对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞损伤具有保护作用,与增加谷胱甘肽合成有关。
　　第二部分尿酸对Nrf2信号通路的调节作用
　　目的:探讨尿酸增加谷胱甘肽生物合成的分子机制。
　　方法:采用6-OHDA损伤SH-SY5Y细胞制造帕金森病细胞模型,分为对照(DMEM)组、6-OHDA(50μmol/L)组、尿酸组(200μmol/L)以及6-OHDA(50μmol/L)+尿酸(200μmol/L)组,预先给予尿酸0.5h后,6-OHDA作用6h用共聚焦法观察Nrf2在胞浆、胞核的分布情况,运用胞浆胞核蛋白提取法后Western blot测定不同组别SH-SY5Y细胞上Nrf2表达情况;用基因转染siRNA敲减Nrf2方法后再运用比色法测定敲减组与未敲减组不同组别谷胱甘肽含量及细胞活力。
　　结果:与对照组相比,50μmol/L6-OHDA作用于SH-SY5Y细胞6h后Nrf2的分布无明显变化,胞浆胞核蛋白也无明显改变;与单独6-OHDA组相比,200μmol/L尿酸作用6h后共聚焦示Nrf2由胞浆明显转入胞核,提取胞浆胞核蛋白后尿酸处理组Nrf2核蛋白含量明显增加(196.33±35.21％vs93.11±29.25％,P<0.05);单独尿酸与对照组比,Nrf2核蛋白含量明显增加(231.36±55.19％vs100.00±33.01％,P<0.01);给予Nrf2-siRNA敲除Nrf2后尿酸+6-OHDA与单独6-OHDA组相比,谷胱甘肽含量无明显改变(4.16±0.12μmol/L vs3.64±0.50μmol/L, P>0.05),细胞活力无明显升高(53.43±2.21％vs51.37±1.69％, P>0.05)。
　　结论:尿酸对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞损伤具有保护作用,与其调节Nrf2信号通路有关。

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序言

第一部分 尿酸增加谷胱甘肽合成减轻6-OHDA对SH-SY5Y细胞损伤作用

材料和方法

1 实验材料

2 实验方法

结果

1、尿酸对6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞形态的观察

2、尿酸对不同时间6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞活力的测定

3、尿酸可减轻6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞总谷胱甘肽含量的降低

4、尿酸升高了谷胱甘肽合成关键酶γ-GCLC的表达量

5、尿酸升高了谷胱甘肽合成关键酶γ-GCLC基因转录水平

讨论

参考文献

第二部分 尿酸对Nrf2信号通路的调节作用

材料和方法

1 实验材料

2 实验方法

3. 统计方法

结果

1. 尿酸促进Nrf2从细胞浆转入细胞核内

2. 尿酸增加SH-SY5Y细胞胞核Nrf2的表达

3. Nrf2-siRNA敲减Nrf2后SH-SY5Y细胞Nrf2表达量

4. Nrf2-siRNA敲减Nrf2后尿酸对谷胱甘肽含量无影响，对SH-SY5Y细胞的保护作用消失。

讨论

参考文献

结论

综述

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攻读硕士期间公开发表的论文

致谢