1,25(OH)2D3抑制人卵巢癌细胞SKOV-3增殖和迁移及其相关机制探讨

摘要

目的：研究1,25(OH)2D3对人卵巢癌SKOV-3细胞的增殖、迁移的抑制作用及其相关机制,为卵巢癌防治提供新思路。
　　方法：⑴研究1,25(OH)2D3对SKOV-3的增殖抑制作用及其机制。以不同浓度1,25(OH)2D3(1、10、100 nM)处理SKOV-3细胞,CCK-8法检测细胞增殖率,流式细胞仪分析细胞周期,TUNEL法检测细胞凋亡,免疫荧光检测维生素D受体(vitamin D receptor, VDR)和β-catenin的表达,Western blotting定量分析VDR、β-catenin、CCND1和FRAT1的表达。⑵以不同浓度1,25(OH)2D3(1、10、100 nM)处理SKOV-3细胞,划痕实验及活细胞工作站系统分析细胞迁移能力,免疫荧光定性定位检测 E-cadherin及 Vimentin的表达,并利用 Western Blotting做定量分析研究1,25(OH)2D3对人卵巢癌细胞系SKOV-3的迁移抑制作用;以10 ng/ml TGF-β处理SKOV-3细胞制作EMT模型,利用划痕实验及活细胞工作站系统分析细胞迁移及运动能力,免疫荧光定性定位检测EMT相关蛋白E-cadherin及 Vimentin的表达,并利用 Western Blotting做定量分析;在此基础上研究1,25(OH)2D3对TGF-β诱导的EMT进程的影响。实验分为:对照组、TGF-β组、VD组、VD+TGF-β组,分别以溶剂对照、TGF-β(10ng/ml)、1,25(OH)2D3(100 nM)、TGF-β(10 ng/ml)+1,25(OH)2D3(100 nM)处理SKOV-3细胞,通过划痕实验及活细胞工作站系统检测SKOV-3细胞迁移能力,Transwell侵袭实验分析细胞侵袭能力,免疫荧光检测VDR、Slug、Snail、β-catenin、E-cadherin和Vimentin的表达, Western blotting定量分析 VDR、Slug、Snail、β-catenin、E-cadherin和 Vimentin的表达。⑶以100 nM1,25(OH)2D3处理SKOV-3细胞,microRNA芯片分析差异表达的microRNAs, Targetscan及miRDB软件对差异microRNAs进行靶基因预测,GSEA数据库对靶基因进行GO及pathway功能富集分析研究1,25(OH)2D3对SKOV-3细胞中microRNAs表达的影响。
　　结果：①1,25(OH)2D3明显抑制SKOV-3细胞增殖,并且存在着剂量-效应和时间-效应关系(P<0.01)。细胞周期分析显示,1,25(OH)2D3可以诱导SKOV-3细胞阻滞于G0/G1期,浓度越高阻滞越明显(P<0.05)。1,25(OH)2D3促进SKOV-3细胞核内DNA断裂点增加,细胞凋亡增多(P<0.05)。免疫荧光结果显示,1,25(OH)2D3促进β-catenin逐渐从细胞核中向细胞质中转移,浓度越高效果越明显;VDR在细胞核与细胞质均有表达,随着1,25(OH)2D3浓度的增加,细胞核内的VDR表达逐渐增加。Western blotting定量发现,1,25(OH)2D3促进SKOV-3细胞中VDR的表达,抑制β-catenin、CCND1和FRAT1的表达,并且存在明显剂量反应关系(P<0.05)。②划痕实验及活细胞工作站均发现1,25(OH)2D3明显抑制SKOV-3细胞的迁移(P<0.05)。Western blotting显示,1,25(OH)2D3促进SKOV-3细胞中E-cadherin表达量的增加、抑制Vimentin表达量的减少,并且存在剂量反应关系(P<0.05)。③单独TGF-β处理 SKOV-3细胞后,细胞形态由细胞间连接紧密,呈椭圆形或多边形的上皮性细胞形态,变成散在生长,长梭形的间质细胞形态;SKOV-3细胞的迁移和运动能力增加;EMT转录因子Slug表达增加,上皮标志物E-cadherin表达降低,而间质标志物Vimentin表达增加,说明TGF-β能够成功诱导SKOV-3细胞发生EMT。划痕实验、活细胞工作站及Transwell实验从细胞的迁移、运动、侵袭三方面证实,1,25(OH)2D3能够抑制TGF-β诱导的卵巢癌细胞迁移作用;免疫荧光显示,对照组VDR受体主要表达于细胞浆中,VD组及VD+TGF-β组VDR受体向细胞核聚集。TGF-β促进Vimentin表达,抑制E-cadherin的表达,VD组则相反;VD+TGF-β组Vimentin表达水平低于TGF-β组,E-cadherin的表达则高于TGF-β组。TGF-β促进 Slug、Snail和β-catenin向细胞核聚集,这一过程可以被1,2(OH)2D3抑制。Western blotting定量分析蛋白表达,结果显示,TGF-β单独处理SKOV-3细胞,促进Vimentin和Slug的表达,抑制E-cadherin的表达,且在第一天作用最明显(P<0.05)。TGF-β对VDR表达没有影响,VD组与VD+TGF-β组VDR受体的表达水平很高,且 VD+TGF-β组 VDR受体的表达水平高于 VD组(P<0.05)。TGF-β促进Slug、Snail、β-catenin和Vimentin的表达,抑制E-cadherin的表达,但这一过程能够1,25(OH)2D3阻止(P<0.05)。④microRNAs表达谱芯片结果显示,差异表达的microRNAs有8个,其中六个下调,分别是 miR-1224-3p、miR-206、miR-4723-5p、miR-5194、miR-634和miR-644b-5p;两个上调,分别是miR-1260a和miR-1280。差异microRNAs中有4个与肿瘤发生相关的差异microRNAs,分别为miR-1280、miR-1224-3p、miR-206和miR-634。靶基因预测显示,总共预测靶基因2086个;靶基因功能富集发现,靶基因分别富集在受体活性、DNA结合、蛋白激酶活性、转入因子活性等分子功能上,细胞大分子代谢、蛋白代谢及修饰、细胞发育、信号转导等生物学过程上以及癌症、MAPK、Wnt、细胞粘附及细胞骨架等信号通路上。靶基因预测分析结果表明,microRNAs可能参与1,25(OH)2D3抑制SKOV-3细胞增殖和迁移所涉及的Wnt通路及EMT过程。
　　结论：⑴1,25(OH)2D3抑制卵巢癌细胞SKOV-3的增殖存在明显的剂量-效应和时间-效应关系,这与1,25(OH)2D3阻滞细胞周期于 G0/G1期、诱导细胞凋亡、阻断Wnt/β-catenin信号通路有关。⑵1,25(OH)2D3抑制人卵巢癌细胞SKOV-3侵袭及迁移能力,这与1,25(OH)2D3下调 Snail、Slug及β-catenin等促进 EMT过程的转录因子和间质细胞标志物Vimentin的表达、上调上皮细胞标志物E-cadherin的表达有关,这些变化可以抑制EMT的发生。⑶分析1,25(OH)2D3处理人卵巢癌细胞SKOV-3差异表达的microRNAs,发现与肿瘤发生相关的差异 microRNAs有 miR-206、miR-1280、miR-634和miR-1224-3p,这些microRNAs可能参与1,25(OH)2D3抑制SKOV-3细胞增殖和迁移所涉及的Wnt通路及EMT过程。

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引言

第一部分：1,25(OH)2D3对SKOV-3细胞增殖的抑制作用

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二部分： 1,25(OH)2D3抑制SKOV-3细胞的迁移及其可能机制

1 方法与材料

2 结果

3 讨论

第三部分：1,25(OH)2D3对SKOV-3细胞中microRNAs表达的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

结论

参考文献

综 述：

研究生期间科研经历与发表的文章

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