异常高表达的Pim-3抑制胃癌细胞凋亡促进胃癌发生发展的实验研究

摘要

胃癌(Gastric carcinoma, GC)是起源于胃上皮的消化系统最常见的恶性肿瘤,严重危害了我国人民的健康。Pim-3是具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的原癌基因,Pim-3在内胚层由来的肝癌、胰腺癌、胃癌组织中过度表达,而在这些正常组织中不表达或者低表达。并且pim-3表达与性别、胃癌淋巴结转移、静脉侵犯有密切关系。已有研究显示Pim-3在胰腺癌细胞株中,通过磷酸化凋亡蛋白分子Bad在112位点的丝氨酸,使其失活,释放出抗凋亡蛋白分子Bcl-XL,从而抑制胰腺癌细胞凋亡,促进肿瘤形成。通过RNA干扰技术(Pim-3 shRNA)瞬时干扰胰腺癌细胞 Pim-3基因表达,可以减弱凋亡分子Bad在112位丝氨酸的磷酸化水平,引起 SubG1期细胞数目增加和细胞周期迟缓,进一步抑制细胞增殖。然而Pim-3在胃癌中的作用及其机制研究甚少,因此我们进一步探讨Pim-3在胃癌中作用的分子机制,为胃癌的靶向治疗提供新的思路。
　　【目的】通过检测胃癌与癌旁组织中Pim-3 mRNA和蛋白来了解Pim-3在胃癌及癌旁组织中的表达差异,通过RNAi技术,敲除胃癌细胞中Pim-3,来探究Pim-3对胃癌细胞增殖、周期、细胞凋亡以及动物皮下肿瘤生长的影响,阐明Pim-3在胃癌发生发展过程中的作用机制,为Pim-3作为胃癌生物靶向治疗手段提供理论依据。
　　【方法】免疫组化检测人胃癌组织标本中Pim-3表达;定量PCR检测胃癌组织中的Pim-3 mRNA的表达水平;通过慢病毒感染建立稳定干扰Pim-3的胃癌细胞系;western blot检测胃癌细胞系中Pim-3表达以及信号转导通路上相关分子的变化; CCK-8试剂盒检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡;克隆形成实验检测胃癌细胞克隆形成能力;动物体内异种移植瘤实验检测细胞体内成瘤情况。
　　【结果】1、胃癌组织中的Pim-3 mRNA和蛋白表达水平明显高于癌旁组织。2、成功的构建了稳定敲除Pim-3的胃癌细胞株。3、敲除Pim-3能显著抑制胃癌细胞的增殖、克隆形成、周期进程并促进细胞的凋亡。4、敲除Pim-3的胃癌细胞株在裸鼠皮下成瘤能力明显小于对照组。5、敲除Pim-3后,胃癌细胞中的细胞周期和细胞凋亡的相关蛋白分子Cdc25C, cyclin B1,phospho-p21T145, Bcl-XL和 P-Bad112的蛋白表达也降低。
　　【结论】胃癌中Pim-3过度表达,促进细胞的增殖、周期进程并且抑制细胞的凋亡,最终促进了胃癌的发生发展,因此开发针对Pim-3的靶分子有望成为新的胃癌靶向治疗的手段。

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前言

材料与方法

1 实验材料

1.1细胞系及细胞培养相关试剂

1.2抗体

1.3组织总RNA抽提相关试剂

1.4 RT-PCR相关试剂

1.5苏木素-伊红( HE)染色、免疫组织化学染色以相关试剂

1.6蛋白抽提相关试剂

1.7蛋白免疫印迹（Western Blot）相关试剂

1.8实验动物

1.9 临床胃癌组织标本

1.10主要仪器

2 实验方法

2.1胃癌和癌旁组织RNA的抽提

2.2 RT-PCR反应

2.3组织石蜡包埋

2.4组织切片

2.5免疫组织化学染色

2.6.siRNA设计

2.7 vsh RNA载体的构建

2.8 病毒包装

2.9 病毒的收获及浓缩

2.10 Lentivirus 滴度测定（孔稀释法测定滴度）

2.11 慢病毒感染胃癌细胞 MGC-803和BGC-823

2.12 筛选稳定干扰Pim-3的胃癌细胞株

2.13蛋白免疫印迹实验

2.14细胞增殖实验

2.15 细胞凋亡检测

2.16克隆形成实验

2.17 动物实验

2.18 数据统计

实验结果

1、 Pim-3在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织

2、稳定敲出Pim-3的胃癌细胞株建立

3、Pim-3对人胃癌细胞增殖的影响

4、Pim-3对胃癌细胞克隆形成的影响

5、Pim-3对胃癌细胞周期的影响

6、敲除Pim-3对胃癌细胞凋亡的影响

7、敲除Pim-3对胃癌细胞裸鼠皮下肿瘤生长的影响

8、敲除Pim-3表达抑制胃癌细胞生长的分子机制解析

讨论

结论

创新性

参考文献

综述

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