儿童脂肪干细胞的成骨诱导及其复合胶原羟基磷灰石支架的生物相容性的实验研究

摘要

本论文包括三个部分:
　　第一部分、儿童脂肪干细胞的分离培养及向成骨细胞诱导
　　目的:研究从儿童脂肪组织中分离培养脂肪干细胞,进行观察和鉴定,为后续实验提供种子细胞。
　　方法:收集手术中弃用切除的脂肪组织,使用酶消化后,通过密度梯度离心获得儿童脂肪干细胞,进行体外分离和培养,倒置显微镜下观察细胞的生长情况, MTT法测定细胞生长活性,流式细胞仪检测细胞表面标志物。选第三代脂肪干细胞向成骨细胞诱导后,进行Von Kossa染色钙化结节和碱性磷酸酶检测。
　　结果:成功的在体外分离培养出儿童脂肪源性干细胞,连续传至20代。MTT法显示细胞生长旺盛;表面标志CD44,CDl05呈阳性高表达,CD34,CD45呈阴性低表达。将其诱导分化为成骨细胞,进行Von Kossa染色钙化结节、碱性磷酸酶检测的结果都为阳性。
　　结论:经体外分离培养、观察和进行有关鉴定,证实所培养出来的是脂肪干细胞,成功将其诱导为成骨细胞。
　　第二部分、胶原/羟基磷灰石复合支架材料的制备和表征
　　目的:制备I型胶原/羟基磷灰石复合支架材料并对其进行表征。
　　方法:将羟基磷灰石分散液和牛腱I型胶原溶胀液依照特定的比例配制支架材料模拟天然骨,利用光学仪器对其进行观察和表征。
　　结果:利用扫描电子显微镜,透射电子显微镜,红外光谱,X射线衍射对材料进行考察。证明了该支架具有良好的承载能力和力学性能。
　　结论:我们制备的I型胶原/羟基磷灰石复合支架材料具有与天然骨相似的特征,为后续实验中的种子细胞提供了载体基础。
　　第三部分、成骨诱导儿童脂肪干细胞复合胶原/羟基磷灰石支架的生物相容性的实验评价
　　目的:将制备的I型胶原/羟基磷灰石复合支架材料结合儿童脂肪干细胞进行体外体内的相容性实验。
　　方法:I型胶原/羟基磷灰石复合支架与第三代成骨诱导的儿童脂肪干细胞复合培养,在倒置显微镜下观察支架材料对细胞的影响;进行支架材料的细胞毒性实验。皮内注射支架材料浸提液观察注射后的变化;另外,在SD大鼠体内包埋二组支架材料:实验组,支架材料结合细胞;对照组,支架材料。2、4、6、8、10周处死动物后,进行大体形态、影像学和组织学检查。
　　结果:体外复合培养显示,在三个不同的时间点贴壁细胞生长良好、生长旺盛;支架材料无毒性。体内实验,1.皮内注射实验,实验组和对照组无明显差异。2.大体形态观察,在术后2周二组大体形态差异不明显。术后6、10周实验组的支架材料形态结构大体存在;对照组的大体形态不复存在,仅见支架材料的少量残余。3.影像学检查:X线透视显示,实验组的植入物密度逐渐增高,对照组的植入物密度降低、形态模糊。4.组织学检查(HE染色),二组前4周的情况相似,都为炎症细胞侵润和组织包裹,毛细血管长入。8周时二组炎症反应基本消失,实验组中出现类成骨细胞,对照组主要是肉芽包裹和少量脂肪细胞。10周实验组中出现类新生骨形成。对照组表现为材料降解吸收。 结论:I型胶原/羟基磷灰石复合支架材料结合成骨诱导的儿童脂肪干细胞在体内外具有良好的生物相容性,而且具有成骨潜能。

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引言

第一部分 儿童脂肪干细胞的分离培养及向成骨细胞诱导

前言

一、材 料

二、主要实验试剂和仪器

三、实验方法

四、结果

五、讨论

六、结论

参考文献

第二部分 胶原/羟基磷灰石复合支架材料的制备和表征

前言

一、实验材料

二、实验方法

三、结果

讨论

结论；

参考文献

第三部分 儿童脂肪干细胞复合胶原/羟基磷灰石支架的体内外生物相容性的实验评价

前言

一、实验材料和仪器

二、实验方法

三、结果

四、讨论

五、结论

参考文献

附图

综述 脂肪干细胞在骨组织工程中的研究进展

附录

攻读硕士研究生期间发表文章

致谢