负性共刺激分子B7-H4与PI3K/AKT信号通路相关性及机制的研究

摘要

B7-H4分子是B7家族共刺激分子家族的一员,能负性调控T细胞免疫反应。早期的研究证明,B7-H4是跨膜蛋白,参与调节免疫反应。本实验室的前期研究发现,B7-H4分子含有核定位序列(NLS),能够穿梭于细胞质与细胞核之间。细胞膜上表达的B7-H4分子已被证实可通过抑制T细胞的增殖来促进肿瘤的生长,而对细胞核B7-H4分子的研究并不多见,个别研究发现,细胞内 B7-H4分子与细胞的增殖和凋亡相关。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路与细胞的生长、增殖和肿瘤的发生、发展密切相关,并且会参与细胞内一些蛋白分子的转位。研究发现,B7-H4可以通过抑制活化T细胞中的AKT信号通路,影响T细胞的增殖,但是,对于PI3K/AKT信号通路对B7-H4亚细胞定位的调节作用尚不清楚。
　　本研究旨在构建B7-H4野生型与核定位序列突变型稳定转染的细胞株,初步研究各稳转细胞株的生物活性,并以野生型 B7-H4稳转细胞株为研究对象,通过控制PI3K/AKT信号通路的活性,探讨其与B7-H4亚细胞定位的关系。
　　本论文主要包括以下两部分内容:
　　一、人B7-H4基因转染细胞株的构建及其生物学功能的初步研究
　　目的：构建B7-H4 WT/293、B7-H4 H250Q/293和Mock/293稳定转染细胞株,并对其生物学功能进行初步研究。
　　方法：将野生型B7-H4基因(B7-H4-WT)、突变体B7-H4基因(B7-H4-MT)和真核质粒 pIRES2-EGFP基因用脂质体共转染法分别转染进入HEK/293细胞,经G418加压筛选,分别用流式细胞术鉴定稳定转染细胞株,通过免疫荧光观测经LMB处理后的B7-H4 WT/293和B7-H4 H250Q MT/293中B7-H4定位情况,并通过体外增殖率分析实验和SCID鼠异种移植成瘤实验检测各转基因细胞的体内和体外增殖率。
　　结果：构建了三株稳定转染的细胞株:B7-H4 WT/293、B7-H4 H250Q/293和Mock/293,免疫荧光结果验证了人 B7-H4核定位序列的存在,对体内和体外生物学功能的研究显示,细胞核B7-H4对细胞增殖有促进作用。
　　结论：成功构建了三株稳定转染的细胞,为进一步研究细胞核B7-H4的作用机制提供了有效地研究工具。
　　二、PI3K/AKT信号通路对B7-H4亚细胞定位调节作用的研究
　　目的：探讨磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶 B(PI3K/AKT)信号通路对负性共刺激分子B7-H4亚细胞定位的调控作用。
　　方法：体外培养稳定转染B7-H4 WT/293细胞株,采用PI3K/AKT特异性抑制剂LY294002处理细胞后,免疫荧光技术结合激光共聚焦显微镜检测B7-H4蛋白在B7-H4 WT/293细胞中亚细胞定位的变化;Western blot法检测分别用PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002、PI3K/AKT信号通路活化剂IGF-1、PI3K/AKT信号通路下游mTORC1抑制剂Rapamycin和PI3K/AKT信号通路下游MDM2抑制剂Nutlin-3处理后,B7-H4蛋白在细胞膜、细胞质和细胞核中量的变化。
　　结果：激光共聚焦显微镜观察结果显示,PI3K抑制剂LY294002作用于B7-H4稳定转染的B7-H4 WT/293细胞株后,与空白对照组相比,B7-H4发生核转移,加入出核转运抑制剂LMB后,核转移的程度显著增加;Western blot结果显示,LY294002抑制PI3K/AKT信号通路活性24h后,B7-H4在细胞膜和细胞质中的定位均显著性降低(P<0.05),而细胞核中B7-H4的定位显著升高(P<0.05);IGF-1活化PI3K/AKT信号通路后,B7-H4在细胞膜的定位显著增加,与 LY294002作用结果相反,说明PI3K/AKT信号通路参与调节B7-H4的亚细胞定位。Rapamycin作用后B7-H4定位变化与LY294002作用类似,但Nutlin-3作用后,B7-H4的定位并没有发生显著变化,提示PI3K/AKT信号通路对B7-H4亚细胞定位的调节可能通过PI3K-AKT-mTORC1途径参与介导。
　　结论：PI3K/AKT信号通路参与调控B7-H4分子在亚细胞水平的定位,并且这一调节作用可能由 PI3K-AKT-mTORC1途径参与介导。

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引言

第一部分 人B7-H4基因转染细胞株的构建及其生物学功能的初步研究

1 材料

1.1 主要试剂

1.2 主要溶液的配制

1.3 实验仪器

1.4 实验动物

2 实验方法

2.1 人B7-H4野生型基因及突变体基因转染细胞的构建及鉴定

2.2 免疫荧光定位 B7-H4在转基因细胞株中的表达

2.3 转基因细胞增殖率分析

2.4 转基因细胞异种移植成瘤实验

2.5 转基因细胞中细胞周期蛋白水平的检测

2.6 统计学分析

3 实验结果

3.1 B7-H4转基因细胞的鉴定

3.2 免疫荧光观察B7-H4在转基因细胞中的定位

3.3 转基因细胞增殖率的分析

3.4转基因细胞异种移植成瘤实验

3.5 转基因细胞中细胞周期蛋白的表达水平

4 讨论

第二部分 PI3K/AKT信号通路对B7-H4亚细胞定位调节作用的研究

1 材料

1.1 主要试剂

1.2 主要仪器

2 实验方法

2.1 细胞培养

2.2 PI3K/AKT信号通路与B7-H4相关性的确定

2.3 Western Blot 检测PI3K/AKT信号通路对B7-H4亚细胞定位的调节作用

2.4 PI3K/AKT信号通路调节B7-H4亚细胞定位下游靶点的确定

2.5 统计学分析

3 实验结果

3.1 LY294002和LMB作用浓度和时间的确定

3.2 免疫荧光检测细胞中B7-H4的定位

3.3 IGF-1浓度确定

3.4 Western blot检测LY294002和IGF-1处理前后B7-H4总蛋白的表达水平

3.5 Western blot检测LY294002处理前后B7-H4在细胞内定位的变化

3.6 Western blot检测IGF-1处理前后B7-H4在细胞内定位的变化

3.7 下游靶点确定

4 讨论

论文总结

参考文献

综述

攻读学位期间公开发表的论文

附录

致谢