失神经肌萎缩的蛋白质组学研究及TRAF6在肌萎缩中的调控作用研究

摘要

第一部分 iTRAQ偶联2DLC MS/MS技术分析胫前肌在失神经支配过程中的蛋白表达差异 目的： 通过定量蛋白质组学技术分析胫前肌在失神经支配后不同时间点的蛋白质表达变化，采用生物信息学分析，筛选出与失神经肌萎缩相关的“关键”蛋白质，研究该蛋白的生物学功能，为揭示失神经肌萎缩的分子机理提供资料，为失神经肌萎缩的防治提供科学依据。 方法： 1.制备大鼠坐骨神经离断模型:SD大鼠24只，随机分为4组，每组6只。1组行假手术，作为对照组;另3组动物行左侧坐骨神经切断术，分为术后1周组、术后4周组和术后8周组; 2.提取肌肉总蛋白，采用Bradford法测定总蛋白浓度，蛋白样品经还原、烷基化、酶解、iTRAQ标记和强阳离子交换色谱分离，然后使用纳升高效液相系统(Nano UPLC system)串联LTQ Orbitrap XL质谱仪采集数据; 3.通过SEQUEST软件鉴定并定量多肽和蛋白质，获得差异表达的蛋白质; 4.通过Swiss-Prot/TrEMBL和GO数据库对差异表达的蛋白进行功能分类，并通过生物信息学方法（GO、KEGG和STRING）分析差异表达的蛋白，筛选出与失神经肌萎缩相关的“关键”蛋白质; 5.通过Western blot方法对部分差异表达蛋白进行验证; 6.体外诱导肌管萎缩模型，探讨关键蛋白的生物学功能。 结果： 1.iTRAQ偶联2DLC MS/MS技术发现260个蛋白质在大鼠胫前肌萎缩过程中的表达发生变化，这些蛋白质主要涉及代谢酶、结构蛋白、信号分子、伴侣蛋白、能量代谢相关蛋白、核蛋白等，代谢酶是最大的一类; 2.这些差异表达的蛋白主要包括4种变化趋势:(1)54个蛋白在失神经支配后胫前肌萎缩过程中表达逐渐下降;(2)17个蛋白在失神经支配后1周或4周上调，随后又表达下降;这两种变化趋势的蛋白主要涉及能量代谢相关蛋白、结构蛋白、核蛋白等。(3)101个蛋白在失神经支配后胫前肌萎缩过程中表达逐渐上升;(4)88个蛋白在失神经支配后1周或4周下调，随后又表达上升;这两种变化趋势的蛋白主要涉及伴侣分子、代谢酶、细胞外基质蛋白、结构蛋白、信号分子以及泛素化蛋白酶体通路相关蛋白等; 3.GO分析显示这些差异表达的蛋白涉及的生物学过程主要包括glycolysis（糖酵解）、tricarboxylic acid cycle（三羧酸循环）和cellular respiration（细胞呼吸）等; 4.KEGG分析显示这些差异表达的蛋白涉及的信号通路主要包括Citratecycle（柠檬酸循环）、Glycolysis/Gluconeogenesis（糖酵解/糖异生）和Neurotrophinsignaling pathway（神经营养信号通路）等; 5.STRING相互作用分析结果提示肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）（在本研究中没有被蛋白质组学技术检测到）可能在失神经肌萎缩过程中表达上调并发挥重要作用; 6.通过Western blot分别对2个高表达蛋白（CRYAB和PEBP1）和2个低表达蛋白（KCRS和PYGM）进行验证，结果与蛋白质组学的检测一致;同时对预测的蛋白TRAF6也进行验证，发现实际表达变化与预测结果一致; 7.TRAF6在地塞米松诱导的C2C12肌管萎缩过程中表达上调，抑制TRAF6的表达可以减轻地塞米松诱导的C2C12肌管萎缩。 结论： 1.iTRAQ偶联2D LC-MS/MS的定量蛋白质组学技术发现260个蛋白质在大鼠胫前肌萎缩过程中的表达发生变化，这些蛋白质主要涉及代谢酶、结构蛋白、信号分子、伴侣蛋白等; 2.生物信息学分析提示能量代谢紊乱在失神经肌萎缩过程中可能发挥重要作用; 3.TRAF6在失神经肌萎缩过程中表达上调，体外抑制TRAF6的表达可以减轻地塞米松诱导的C2C12肌管萎缩。 第二部分 TRAF6在失神经肌萎缩中的作用及机制研究 目的： 探讨TRAF6在失神经肌萎缩过程中的作用及调控机制。 （一）抑制TRAF6可延缓失神经肌萎缩 方法： 1.制备坐骨神经离断模型:SD大鼠16只，行左侧坐骨神经切断术，术后随机分为2组（实验组和对照组），手术当天实验组就给予胫前肌多点注射TRAF6siRNA,对照组给予胫前肌多点注射scramble RNA，以后每隔两天注射一次，共注射5次，第14天取胫前肌; 2.通过称重法分析胫前肌的湿重比，通过Masson三色染色法分析胫前肌肌纤维截面积; 3.通过Western blot方法检测TRAF6在实验组和对照组胫前肌中的表达变化，同时检测其下游靶基因MuRF1和MAFBx在实验组和对照组胫前肌中的表达变化。 结果： 1.在失神经支配胫前肌中注射TRAF6 siRNA，结果发现TRAF6 siRNA注射组的胫前肌湿重比以及肌纤维截面积均明显大于对照组(P＜0.05); 2.TRAF6 siRNA注射组胫前肌中的TRAF6表达受到明显抑制(P＜0.05)，TRAF6下游靶基因MuRF1和MAFBx也受到显著抑制(P＜0.05)。 （二）miR-351与TRAF63'UTR相互作用 方法： 1.通过realtime RT-PCR检测miR-351在失神经肌萎缩过程中的表达变化;分析其与TRAF6表达的相关性; 2.构建含有靶基因TRAF63'-UTR野生型及TRAF63'-UTR突变型(seedregion mutant)的双荧光素酶报告基因系统; 3.将TRAF63'-UTR野生型或TRAF63'-UTR突变型与miR-351 mimic或miRNA mimic Negative Control共转染HEK293细胞，检测荧光素酶活性。 结果： 1.miR-351在失神经肌萎缩过程中的表达逐渐下降，miR-351和TRAF6在失神经肌萎缩过程中的表达呈负相关; 2.成功构建含TRAF63'-UTR野生型及TRAF63'-UTR突变型的双荧光素酶报告基因系统; 3.荧光素酶报告基因系统分析发现，miR-351可以显著抑制含有野生型TRAF63'-UTR质粒的荧光素酶活性，对含有突变型TRAF63'-UTR质粒的荧光素酶活性没有影响。 （三）miR-351可延缓失神经肌萎缩 方法： 1.制备坐骨神经离断模型:SD大鼠16只，行左侧坐骨神经切断术，术后随机分为2组（实验组和对照组），手术当天实验组就给予胫前肌多点注射miR-351agamir,对照组给予胫前肌多点注射miRNA agomir Negative Control，以后每隔两天注射一次，共注射5次，第14天取胫前肌; 2.通过称重法分析对胫前肌的湿重比，通过Masson三色染色法分析胫前肌肌纤维截面积; 3.通过realtime RT-PCR检测miR-351在实验组和对照组胫前肌中的表达变化，通过Western blot方法检测TRAF6及其下游靶基因MuRF1和MAFBx在实验组和对照组胫前肌中的表达变化。 结果： 1.在失神经支配胫前肌中注射miR-351 agamir，结果发现实验组胫前肌湿重比以及肌纤维截面积均明显大于对照组(P＜0.05); 2.miR-351 agamir注射组胫前肌中的TRAF6表达受到明显抑制(P＜0.05)，TRAF6下游靶基因MuRF1和MAFBx也受到明显抑制(P＜0.05)。 结论： 1.抑制TRAF6的表达可延缓失神经支配骨骼肌萎缩; 2.miR-351和TRAF6在失神经肌萎缩过程中的表达呈负相关，miR-351与TRAF63'UTR之间存在相互作用; 3.miR-351可通过靶向抑制TRAF6的而延缓失神经支配骨骼肌萎缩。

目录

声明

摘要

前言

参考文献

第一部分 iTRAQ偶联2DLC MS／MS技术分析胫前肌在失神经支配过程中的蛋白表达差异

引言

材料

方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 TRAF6在失神经肌萎缩中的作用及机制研究

引言

材料

(一)抑制TRAF6可延缓失神经肌萎缩

方法

结果

(二)miR-351与TRAF6 3’UTR相互作用

方法

结果

(三)miR-351可延缓失神经肌萎缩

方法

结果

讨论

结论

参考文献

全文总结

综述 骨骼肌萎缩的分子机制研究进展

英文缩略词表

发表论文

博士生期间承担科研项目

致谢