BET蛋白抑制剂I-BET151预防急性移植物抗宿主病的作用研究

摘要

一、体外I-BET151对树突状细胞/T细胞功能的作用研究
　　目的:体外条件下，研究I-BET151对树突状细胞/T细胞功能的影响。
　　方法:①C57BL/6(B6，H-2b)小鼠骨髓源树突状细胞(BMDCs)的培养。取B6小鼠胫腓骨，冲洗获得骨髓细胞，RPMI完全培养基，20ng/ml GM-CSF条件下培养7天，经抗CD11c磁珠分选获得BMDCs，流式细胞仪检测纯度;②I-BET151对BMDCs细胞活力的影响。4h、8h、24h三个时间点，250nM、500nM、1μM、5μM四个浓度条件下将BMDCs与研究药物(I-BET151)或对照(DMSO)共孵育，通过AnnexinⅤ和7-AAD流式检测细胞凋亡情况;③I-BET151对BMDCs细胞表面MHC-Ⅱ和共刺激分子表达的影响。BMDCs静息和脂多糖(LPS)刺激条件下，与对应浓度I-BET151或DMSO共孵育6小时后，流式检测细胞CD40、CD80、CD86、PDL1和MHC-Ⅱ分子的表达水平;④I-BET151对BMDCs促炎性因子分泌功能的影响。BMDCs与相应浓度I-BET151或DMSO共孵育，经250ng/ml LPS刺激6h后收集上清，ELISA法检测IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12及TNF-α浓度;或刺激3h后收集细胞提取RNA并逆转成cDNA，real-time PCR技术检测相应基因表达情况;⑤I-BET151对BMDCs刺激T细胞增殖作用的影响。A）通过体外混合淋巴细胞反应体系，以BALB/c(H-2d)小鼠脾脏分选的CD90.2+细胞作为反应T细胞，I-BET151或DMSO孵育并60Co辐照后的B6小鼠BMDCs作为刺激细胞，共培养96h，3H掺入法检测反应细胞增殖效应，或CFSE标记BALB/c小鼠T细胞，流式测定增殖效应并通过AnnexinⅤ检测凋亡水平。⑥I-BET151对T细胞增殖和功能的直接作用。CFSE标记BALB/c小鼠脾脏分选的CD90.2+T细胞，CD3/CD28条件下与250nM I-BET151或DMSO共孵育48h，3H掺入法及流式测定增殖效应，并AnnexinⅤ检测T细胞凋亡水平，同时收集上清，ELISA法检测IFN-γ、 IL-2、IL-4、IL-10及IL-17浓度。
　　结果:①经体外扩增7天及抗CD11c磁珠分选后，每只小鼠骨髓约可获得25×106个细胞，流式检测提示CD11c+细胞比例大于96％;②I-BET151呈剂量、时间依赖性影响BMDCs细胞活力:当共孵育时间低于8h时，1μM浓度的I-BET151不会明显增加细胞凋亡比例，但当孵育24小时后，与DMSO对照组相比，药物组细胞凋亡率明显上升，其中1μM组接近40％（对照组约15％）;③无论静息还是LPS刺激条件下，与I-BET151共孵育6个小时后，BMDCs细胞表面CD40、CD80、CD86、PDL1和MHC-Ⅱ分子的表达水平均有明显降低，下降幅度与药物剂量正相关，其中以CD86最为显著;④I-BET151能显著抑制LPS刺激后BMDCs分泌炎性因子的能力，同时I-BET151的抑制作用具有一定选择性，IL-12最明显，IL-6居中，而对TNF-α的抑制作用相对温和;⑤经I-BET151孵育后的BMDCs促T细胞扩增的功能明显受到抑制，抑制程度与药物浓度正相关;与对照组相比，T细胞凋亡水平没有明显变化。⑥250nMI-BET151对T细胞增殖有直接的抑制作用，同时不增加T细胞凋亡，并显著降低T细胞分泌IFN-γ、 IL-17水平，提高IL-2和IL-4水平。
　　结论:I-BET151呈剂量和时间依赖性诱导小鼠BMDCs的凋亡，但1μM浓度条件下孵育8个小时不会显著增加细胞凋亡比例;I-BET151能显著抑制BMDCs细胞的功能:降低MHC-Ⅱ和共刺激分子的表达，抑制炎性因子的分泌，降低促T细胞增殖作用;I-BET151能直接抑制T细胞的增殖，并改变T细胞炎症因子的表达谱。
　　二、I-BET151预防急性移植物抗宿主病的作用及机制
　　目的:研究移植期短程应用I-BET151能否减轻小鼠异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后急性移植物抗宿主病(aGVHD)的严重程度。
　　方法:①以同基因HSCT及BALB/c→B6及B6→BALB/c两个小鼠清髓性allo-HSCT后aGVHD模型验证移植期短程(-1d～+5d)应用I-BET151是否具有减轻aGVHD的作用。②以B6→BALB/c小鼠allo-HSCT为模型，移植后7天、14天ELISA法测定受体血清IL-1、IL-6、TNF-α浓度，流式检测受鼠脾脏中供体CD4+、CD8+细胞数量及Treg细胞比例，组织病理检测aGVHD严重程度。
　　结果:①小鼠同基因移植模型中，移植前-1d至移植后+5天共7次的I-BET151药物干预治疗不会影响供体细胞植入，实验也未观察到其它明显不良反应;I-BET151在2种小鼠异基因移植模型中，均能明显减轻移植后aGVHD的严重程度，与对照组相比，实验组小鼠生存期显著延长;②移植后+7天，I-BET151组小鼠血清IL-6、TNF-α水平显著降低，脾脏内供体CD4+、CD8+细胞数量也较对照组明显减少，肝脏、小肠、大肠的aGVHD严重程度显著低于对照组，但两组之间供体嵌合水平无显著性差异，Treg细胞比例也不存在显著不同。
　　结论:小鼠allo-HSCT后短程应用I-BET151能明显降低aGVHD严重程度，显著改善生存率。其作用机制可能与抑制DCs细胞功能，降低细胞因子风暴强度，抑制供体效应T细胞增殖有关。同时I-BET151不影响供体细胞植入。
　　三、I-BET151对树突状细胞/T细胞NF-κB信号通路的影响
　　目的:研究I-BET151对BMDCs和T细胞NF-κB信号通路的作用。
　　方法:①按上述方法获得B6小鼠BMDCs，500nM I-BET151实验组及DMSO对照组，予250ng/ml LPS刺激，Western Blot法动态测定0h、1/2h、1h、2h、4h细胞胞浆IκBα降解情况，及0h、1/4h、1/2h、1h ERK蛋白磷酸化水平;②同上，LPS刺激6h，Western Blot法测定细胞刺激前后BRD4，RelA和Acetyl-310 RelA表达水平。③免疫共沉淀法检测I-BET151对BRD4/Acetyl-310 RelA结合的作用。④B6小鼠CD90.2+T细胞CD3/CD28孵育24h条件下重复实验②、③。
　　结果:①与对照组相比，I-BET151对LPS刺激后BMDCs胞浆中IκBα的降解和重新合成过程无明显干扰作用，同时对ERK的磷酸化过程也无明显影响;②LPS或CD3/CD28抗体作用后，BMDCs及T细胞Acetyl-310 RelA表达水平显著增强，I-BET151对RelA的乙酰化无明显抑制作用;③I-BET151能阻断BRD4与acetyl-310RelA间的结合。
　　结论:I-BET151不影响NF-κB通路和MAPK/ERK的激活，但能阻断BRD4与acetyl-310 RelA的结合，这可能是I-BET151抑制树突状细胞、T细胞功能的一个重要作用机制。