基于LC--QTOF/MS的儿童性早熟代谢组学研究

摘要

目的: 随着生活环境的变化，儿童性发育异常，特别是性早熟的发病率显著增高，已成为目前常见的小儿内分泌疾病之一。性早熟对儿童身心发育造成很大的不利影响，很容易造成孩子的心理障碍，甚至误入歧途而引起一些社会问题。因此，儿童性早熟的早诊断、早治疗十分重要。目前，临床诊断及检测方法并不能有效地达到早期诊断的目的。近年来，由于代谢组学（metabolomics）的发展为疾病的诊断提供了新的方法和途径。代谢组学借助高通量、高灵敏度与高精确度的波谱研究和模式识别方法，可从整体和系统的角度直接反映机体对外界病理生理刺激与干预作用的应答。本实验运用高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用法（HPLC-QTOF/MS）对性早熟儿童和健康儿童血液进行检测，同时运用多元统计方法对所得的数据进行统计学处理，探索性早熟儿童的代谢变化，从而为儿童性早熟发病机制提供代谢组学实验依据，同时也为建立一种基于代谢组学的性早熟早期诊断方法及建立治疗方案奠定基础。 方法: 首先，采用血清-乙腈(1∶3)沉淀蛋白，离心后取上清液过captiva-lipid柱的方法对临床采集的血清样本进行去除蛋白质等大分子物质处理;其次，运用高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用法（high performance liquid chromatographycoupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry, HPLC-QTOF/MS）对样本进行检测，获得病理组和健康组代谢图谱和相关数据。色谱条件:采用AgilentPoroshell120 Bonus-RP（2.1×100mm，2.7μm）色谱柱;流动相为0.1％甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱分别为正离子模式:0～1min10％B，1～11min B增至60％，11～29min B增至95％，29～34min B95％;负离子模式:0～1min10％B，1～6minB增至60％，6～16minB增至75％，16～30min B增至95％，30～35minB95％;流速为0.25 mL/min;柱温为40℃;进样量5μL。质谱条件:分别采用电喷雾正离子模式(ESI+)和负离子模式（ESI-）对样品进行检测;数据采集范围m/z100～1700;毛细管电压为4000V，喷针电压为1000V;鞘气温度为250℃;雾化器压力为45psi;干燥气流量为10L/min;干燥气温度为350℃;碎裂电压为140V。然后，采用主成分分析(principal component analysis，PCA)、偏最小二乘判别分析（partial least square-discriminant analysis，PLS-DA）对实验数据进行分析，用于考察性早熟患儿和健康儿童的差异，寻找对二者区分贡献较大的化合物，同时考察这些化合物对性早熟诊断的预测能力。 结果: 通过实验条件的优化，建立了测定血液中代谢产物的HPLC-QTOF/MS法。采用该方法测定了23例性早熟儿童和43例正常儿童血液样本中的代谢物相对含量。经统计分析，PCA得分图(score plot)显示性早熟儿童和正常儿童血液代谢特征存在明显差异。根据PLS分析的载荷图和VIP值，筛选出对数据分型具有显著影响的离子，鉴别得到24个代谢标记物，对其参与的代谢途径进行了分析，并运用PLS-DA法对生物标记物的预测能力进行验证。 结论: LC-MS是代谢组学研究中常用的分析工具，本研究对性早熟儿童和正常儿童血液进行代谢组学研究，获得性早熟儿童和正常儿童的代谢图谱，结合统计学方法得到生物标记物，实验结果证明这些标记物对性早熟有较好的预测能力。

目录

声明

摘要

引言

材料与方法

1 材料

1．1 仪器

1．2 试剂

2 方法

2．1 实验样本与处理

2．2 分析条件

2．3 质量控制

2．4 数据处理方法

结果

1 方法的建立

1．1 样品前处理方法的建立

1．2 色谱柱的选择

1．3 色谱及质谱条件的优化

1．4 进样重复性考察

2 质量控制结果

3 样品总离子流色谱图分析

4 数据分析结果

4．1 主成分分析

4．2 潜在标记物

4．3 与性早熟有关的代谢通路

小结与讨论

结论

参考文献

综述：性早熟的研究现状及诊断方法进展

在校期间发表的学术论文目录

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致谢