硫辛酸胺在实验性蛛网膜下腔出血早期脑损伤中的神经保护作用及相关机制的实验研究

摘要

目的：硫辛酸（α-lipoic acid LA）是常见含有巯基的抗氧化剂，其在蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage SAH）模型中的神经保护作用已经被证实。硫辛酸胺(α-lipoic acid-plus LAP)是LA的衍生物，体外实验中，LAP通过螯合溶酶体内铁抑制细胞的氧化应激损伤这一观点已经证实。由于溶酶体内特定的酸性环境，LAP（PKa=8.0）比LA（PKa=5.4）更容易地进入溶酶体内，且与溶酶体内自由铁反应，然而LAP的神经保护的机制还未完全阐述。因此，设计本实验来评估LA，LAP两者在SAH后早期脑损伤（early brain injury EBI）中神经保护作用的差异，以及探讨LAP产生神经保护作用机制。
　　方法：实验1：42只健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为7组，每组6只，假手术组，SAH+vehicle组，LA（100 mg/kg）组，LAP(50 mg/kg)组，LAP(100 mg/kg)组，LAP(150 mg/kg)组和LAP(200 mg/kg)组。视交叉前池一次注入自体非肝素化动脉血0.3 ml构建SAH活体大鼠模型。LA，LAP均通过胃管给药，首次给药在注血后的4小时，后连续三天，每天给药一次。72小时后大鼠处死冰盐水灌注取脑，经脱水，固定和包埋切片，进一步行溶酶体膜蛋白-1（Lysosomal-associated membrane protein-1 LAMP-1)/神经元特异性核蛋白（Neuron-specific Nuclear Protein NeuN）和LAMP-1/胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein GFAP）免疫荧光共染来评估SAH后神经细胞内的溶酶体数量及膜的稳定性。实验2：90只健康成年雄性SD大鼠随机分为5组，每组18只，假手术组，SAH+vehicle组，LA（100 mg/kg）组，LAP(100 mg/kg)组和LAP(150 mg/kg)组。72小时后灌注取脑，蛋白质印迹（western-blot WB）和免疫荧光共染法分析脑组织中的组织蛋白酶B/D（Cathepsin B/D），凋亡蛋白-3（caspase-3），Bax，铁蛋白（ferritin）和血红素氧合酶-1（heme Oxygenase-1 HO-1）的表达情况。脑组织切片铁染色评估铁含量，干湿法测定水肿指数，伊文氏蓝（evansblue EB）来评价出血后的血脑屏障（blood–brain barrier BBB）的通透性，末端标记法（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling TUNEL）染色测定神经细胞的凋亡，相关的试剂盒来测定新鲜脑组织中氧化应激指标。
　　结果：
　　实验1：72小时后，通过比较各组之间的荧光强度，得出SAH组中LAMP-1在神经元细胞质中的表达较假手术组显著减弱，与LA组相比，LAMP-1在LAP(100 mg/kg)组中荧光强度最强；但在星型胶质细胞中，我们发现假手术组，SAH组和干预组之间的荧光强度无明显差异。因次，我们选择LAP(100 mg/kg)，LAP(150 mg/kg)两个剂量行第二部分的实验。
　　实验2：72小时后，与假手术组相比，我们观察到Cathepsin B/D，caspase-3，Bax，ferritin和HO-1在脑组织中表达水平显著上调，LA，LAP不仅能显著抑制上述蛋白的表达，同时大鼠神经功能缺陷，脑水肿含量，血脑屏障通透性，铁沉积，皮层细胞的凋亡率和氧化应激指标都得到了明显的改善，值得注意的是，高剂量LAP神经保护效果最佳。
　　结论：LAP在实验性SAH后EBI中可以靶向作用于溶酶体内铁，稳定溶酶体膜，抑制Cathepsins的释放，阻断Cathepsins介导的凋亡通路发挥神经保护作用。

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前言

参考文献

第一部分 硫辛酸胺干预蛛网膜下腔出血后神经细胞内溶酶体膜稳定性的实验研究

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 硫辛酸胺靶向溶酶体内铁抑制组织蛋白酶介导的凋亡通路在大鼠蛛网膜下腔出血后产生神经保护作用机制的实验研究

材料和方法

结果

讨论

总结

参考文献

综述: 组织蛋白酶异常表达在继发性脑损伤中的研究进展

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