BCL11A在中国急性髓系白血病病人中的表达水平及其调控机制研究

摘要

目的：选取5个急性髓系白血病(AML)相关基因，对新诊断的中国和欧洲血统占主要优势的西方AML患者进行基因突变差异比较。研究BCL11A在中国AML患者中的表达水平。对BCL11A上游调控机制进行深入研究，包括转录起始位点鉴定，启动子活性分析，髓系分化关键调控因子CEBPα在BCL11A启动子上结合位点的鉴定以及CEBPα对BCL11A的转录调控研究。进一步探讨BCL11A在白血病发生过程中起到的致癌基因作用。
　　方法：⑴收集AML患者骨髓样本269例，PCR扩增NF1，TP53，NRAS，FLT3，DNMT3A5个AML相关基因并进行测序鉴定，分析鉴定其突变情况。⑵TaqMan探针实时荧光定量方法，精确定量AML患者中BCL11A的表达水平，并与12例正常人骨髓样本进行比较，分析其表达是否失调。⑶生物信息学分析及5'-RACE方法对BCL11A转录起始位点进行鉴定。⑷构建BCL11A启动子及启动子系列缺失体，通过双荧光素酶报告基因系统分析启动子活性。对活性显著的启动子再次进行生物信息学分析，分析其可能的转录因子结合位点。⑸通过构建CEBPA相关表达载体，与BCL11A启动子共转染，CEBPA突变，启动子结合位点突变等实验鉴定CEBPα对BCL11A启动子活性的影响。⑹通过过表达CEBPA实验验证其对内源BCL11A表达的影响。⑺构建HL-60细胞分化模型，通过分化等实验来研究ATRA诱导HL-60髓系分化过程中BCL11A所起的作用。
　　结果：①NF1，TP53，DNMT3A，NRAS，FLT3在中国AML患者中的突变频率分别为0，＜1％，6％，7％，23％。且这5个基因突变与临床特征包括年龄、性别、FAB-type和细胞遗传学等没有显著的联系。除FLT3-ITD外，其余四个基因在中国AML患者中的突变频率均低于欧洲血统占主要优势的西方AML患者。②BCL11A在中国AML患者中表达失调，表现出一定的高表达。③5'-RACE实验发现BCL11A存在新转录起始位点，在NCBI公布的转录起始位点基础上继续向上游延伸142bp。④BCL11A新转录起始位点上游500bp碱基序列具有显著的启动子活性。⑤转录因子CEBPα抑制BCL11A启动子活性，且抑制作用随着CEBPA表达时间的延长和表达量的增加而加深。CEBPA基因突变后，抑制作用消失。对BCL11A启动子上CEBPα可能的结合位点进行定点突变后，BCL11A启动子活性上升约40％。⑥CEBPA过表达抑制内源BCL11A表达。⑦HL-60细胞分化过程中，CEBPA表达水平上升，BCL11A表达水平降低，两者呈现负相关。而过表达BCL11A则会抑制HL-60细胞分化。
　　结论：本研究发现与西方研究相比，AML发生密切相关的基因在中国AML患者中突变频率普遍偏低，提示在中国AML的发生发展中可能有其他基因通过其他尚未被发现的机制起作用。首次发现BCL11A在中国AML患者中表达失调。并在随后的BCL11A分子遗传调控网络研究中鉴定了新的BCL11A转录起始位点，还首次发现髓系分化过程中关键的调控因子CEBPα可能作为一个主要的转录因子抑制BCL11A的表达，并且抑制作用随着CEBPA表达时间的延长和表达量的增加而加深。HL-60细胞分化过程中，内源CEBPA表达上升并抑制内源BCL11A的表达，两者呈现负相关，并且BCL11A高表达会抑制HL-60细胞分化。提示BCL11A的表达下调是介导CEBPα诱导髓系分化的重要事件。为进一步证实BCL11A在白血病发生过程中起到致癌基因作用打下坚实的基础。

目录

声明

摘要

第一部分 常见AML相关基因在中国AML患者中的突变分析及中西方差异比较

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 BCL11A在中国急性髓系白血病病人中的表达水平研究

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 BCL11A基因的上游调控网络：启动子研究和CEBPα对BCL11A的转录调控机制研究

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

结论

综述 急性髓系白血病中的基因突变研究进展

攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文

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