腺病毒介导的HER2-siRNA联合顺铂对人卵巢癌移植瘤的治疗效应及SPECT显像监测研究

摘要

目的：构建针对Her2/neu的RNA干扰腺病毒载体包装重组腺病毒，观察重组腺病毒感染移植瘤并联合化疗药物顺铂对人卵巢癌移植瘤的治疗作用，并用131I-Herceptin作显像剂，SPECT显像活体监测腺病毒介导的HER2-siRNA对移植瘤内HER2表达的干扰效应，为进一步研究卵巢癌的基因治疗奠定实验基础。
　　方法：①根据本实验室前期研究已经筛选出干扰效率满意的HER-2/neu-shRNA序列，构建及鉴定特异性的HER2-siRNA腺病毒载体及一条随机序列的阴性对照腺病毒载体。②将上述载体经Lipofectamine2000转染到HEK293细胞中，采用AdMax腺病毒包装系统进行腺病毒的包装，并通过Adeno-X?Virus Purification Kit方法纯化腺病毒，运用终点稀释法测定腺病毒滴度。③卵巢癌SKOV-3细胞接种BALB/c裸鼠后随机分组进行治疗实验：瘤内及瘤周注射特异性的HER2-siRNA腺病毒（Ad-HER2-RNAi组）、阴性腺病毒（NC组）及PBS（CON组），检测各组瘤体大小、瘤体重量、免疫组化测定各组HER2蛋白表达，利用131I-曲妥珠单克隆抗体（Herceptin）分别对荷卵巢癌移植瘤裸鼠进行SPECT放射免疫显像，研究裸鼠间隔15天的两次重复显像、不同剂量的131I-Herceptin显像变化及计算各实验组肿瘤/本底（T/B）比值。④荷卵巢癌移植瘤裸鼠随机分五组进行联合治疗实验：特异性的HER2-siRNA腺病毒和顺铂（Ad-HER2-RNAi+DDP组）、特异性的HER2-siRNA腺病毒和生理盐水（Ad-HER2-RNAi组）、PBS和顺铂（DDP组）、阴性腺病毒和生理盐水（NC组）、PBS和生理盐水（CON组），每组的DDP和生理盐水是腹腔注射给药，其余为瘤内及瘤周注射。检测各组裸鼠体重、瘤体大小、瘤体重量、免疫组化测定各组 HER2蛋白表达，利用131I-Herceptin对每组裸鼠进行SPECT放射免疫显像，分析图像变化，计算各组肿瘤/本底（T/B）比值。
　　结果：①成功构建 HER2-siRNA干扰序列及随机序列的腺病毒穿梭质粒，测序证实序列正确。②重组腺病毒成功包装，获得了高滴度1×1011 PFU/mL的腺病毒。③Ad-HER2-RNAi组移植瘤与CON组和NC组相比，平均瘤体积、瘤体重量均明显减小（P＜0.05）；免疫组化结果亦证实 Ad-HER2-RNAi组 HER2蛋白的表达明显下调；各组裸鼠经尾静脉注射131I-Herceptin后1h即可见移植瘤部位显影，瘤体影像随时间延长显影逐渐清晰，间隔15d裸鼠重复显像无明显差异，不同剂量显像剂对图像无明显影像，因而后续实验选择中等剂量7.4MBq的131I-Herceptin作为每次显像用量；比较各时间点T/B值及经组织厚度校正后的T/B值，Ad-HER2-RNAi组与CON组和NC组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。④联合治疗实验结果显示：与CON组和NC组比较，Ad-HER2-RNAi组和DDP组和Ad-HER2-RNAi+DDP组裸鼠移植瘤的平均瘤体积和重量明显下降（均P＜0.01），其中以后者更明显。免疫组化结果显示上述三组 HER2蛋白的表达均下调，联合用药组更明显。SPECT显像结果示三组治疗组各时间点T/B原始比值及T/B校正值均低于CON组和NC组，差异有统计学意义（均P＜0.01）。Ad-HER2-RNAi+DDP组各时间点T/B原始比值与Ad-HER2-RNAi组和DDP组相比，差异有统计学意义（均P＜0.05）。经校正后，除1h时间点外，其余各时间点联合用药组T/B校正值均低于单用药组，差异有统计学意义（均P＜0.05）。
　　结论：特异性HER2-siRNA重组腺病毒感染高表达HER2的人卵巢癌移植瘤后，可以有效地抑制肿瘤的生长，与化疗药物顺铂联合应用有协同抑瘤效应。SPECT显像能活体实时监测和评价HER2-siRNA的干扰效应。

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引言

实验流程

第一部分 HER2-shRNA腺病毒载体的构建及包装

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

第二部分 腺病毒介导的HER2-shRNA治疗人卵巢癌荷瘤裸鼠的体内实验研究

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

第三部分 联合顺铂对人卵巢癌移植瘤的基因治疗及干扰效应显像研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨 论

结论

参考文献

综述:用于基因治疗的病毒载体研究进展

中英文对照缩略词表

攻读学位期间公开发表的论文

致谢