稀土上转换发光纳米材料用于近红外光激发的光动力治疗联合肿瘤基因治疗的研究

摘要

第一部分用于光动力治疗的稀土上转换发光纳米材料的制备及应用初步探究
　　目的:探讨稀土上转换发光纳米材料（UCNP）经聚乙二醇、聚乙烯亚胺通过层层组装的方法修饰后并连接上光敏剂二氢卟吩 e6(Ce6)形成的多功能复合纳米材料UCNP-PEG@2×PEI-Ce6用于近红外光激发的光动力治疗应用的可行性及价值。
　　方法:
　　1)采用高温热分解法制备出掺杂Gd3+的上转换纳米颗粒NaGdF4(Gd: Yb: Er=78％:20%:2%)，首先利用聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)高分子聚合物修饰纳米粒子增加其水溶性，再通过层层组装的方式将纳米粒子表面修饰两层聚乙烯亚胺(polyethylenimine, PEI)层，最后得到带有足够正电荷并且仍然具有良好生物相容性的UCNP-PEG@2×PEI复合纳米材料，并对其形貌、电位进行表征研究。
　　2)将光敏剂二氢卟吩 e6(Ce6)分子通过疏水作用力装载 UCNP-PEG@2×PEI，形成 UCNP-PEG@2×PEI-Ce6复合物，计算Ce6装载效率及释放率，并对复合物荧光性质进行表征，检测复合物单线态氧的产生。
　　3)将不同浓度梯度的UCNP-PEG@2×PEI-Ce6进行磁共振T1序列的扫描，检测其磁共振成像性质。
　　4)通过体外细胞毒性试验（MTT）对UCNP-PEG@2×PEI-Ce6颗粒的体外毒性进行研究。
　　5)将不同浓度梯度的UCNP-PEG@2× PEI-Ce6转染人宫颈癌（HeLa）细胞4小时后，近红外光(980nm)照射20分钟后，测定细胞存活率。
　　结果:
　　1)透射电子显微镜（TEM）显示，荧光上转换纳米颗粒（UCNP）是水溶性良好的单分散纳米晶体，平均直径约在30nm。经过层层修饰以后，UCNP-PEG@2×PEI颗粒在水溶液中仍然具有较好的稳定性；修饰第二层聚乙烯亚胺之后的UCNP-PEG@2×PEI纳米颗粒较修饰第一层聚乙烯亚胺（PEI）之后带有更多的正电荷；
　　2)当UCNP与 Ce6的质量比为2:1时，Ce6装载率可达10%-11%，再增加装载量会导致UCNP-PEG@2×PEI-Ce6稳定性的下降。
　　3)上转换发光荧光强度显示修饰两层PEI之后的纳米颗粒仍然显示出较高的上转换荧光强度。然而，在UCNP-PEG@2×PEI装载光敏剂Ce6之后，上转换荧光强度明显下降，尤其在与Ce6吸收峰重叠的660nm发射峰处。
　　4)在980nm激光的照射下，随着时间的延长，UCNP-PEG@2×PEI-Ce6产生的单线态氧逐步增加，而游离的Ce6分子则不能产生单线态氧。
　　5)磁共振T1WI成像结果显示在一定的浓度梯度内，随着材料浓度的增加，UCNP-PEG@2×PEI-Ce6磁共振信号逐渐增加。
　　6)体外细胞毒性实验结果显示UCNP-PEG@2×PEI-Ce6在较高浓度时对细胞亦未见明显毒性作用。7)在980nm激光照射下，UCNP-PEG@2×PEI-Ce6随着浓度的升高，在细胞水平显示出良好的光动力治疗效果。
　　结论:修饰了两层PEI后的稀土上转换发光纳米材料带有较多正电荷，且生物相容性及上转换荧光强度仍然较高。UCNP-PEG@2×PEI可以通过疏水作用装载光敏剂Ce6。细胞增殖实验结果表明，UCNP-PEG@2×PEI-Ce6复合物没有明显的生物毒性，同时具有较好的磁共振成像能力。近红外光照射下，UCNP-PEG@2×PEI-Ce6独特的上转换光致发光的性能可以激发Ce6产生单线态氧，实现近红外激发下的光动力治疗，大大提高了治疗的穿透深度。因此，UCNP-PEG@2×PEI-Ce6可以作为一种新兴的纳米载体，用于肿瘤诊断与治疗。
　　第二部分稀土上转换发光纳米材料用于基因转染及近红外光激发的光动力治疗联合基因治疗的研究
　　目的:稀土上转换发光纳米材料作为新式纳米基因载体用于基因治疗以及近红外光激发下的光动力治疗联合基因治疗的研究。
　　方法:
　　1）用凝胶阻滞电泳实验测定 UCNP-PEG@2×PEI-Ce6复合物和小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）的结合能力大小。将不同N/P比例(5，10，15，20)对应下的不同浓度的UCNP-PEG@2×PEI-Ce6水溶液和1?g siRNA混合，在室温下将二者孵育20分钟后进行0.8%凝胶阻滞电泳。
　　2）体外无血清及血清存在两种条件下，按照不同的N/P比例，将UCNP-PEG@2×PEI-Ce6与Plk1 siRNA(siPlk1)孵育20分钟后转染人宫颈癌细胞（HeLa）。
　　3）共聚焦显微镜观察细胞摄取UCNP-PEG@2×PEI-Ce6/FAM-siRNA复合物的情况以及血清存在情况下对FAM-siRNA转染的影响。
　　4）通过Western blotting以及RT-qPCR实验研究不同N/P比例及血清存在与否情况下 UCNP介导的siPlk1转染对 HeLa细胞对应的蛋白及mRNA表达水平的影响。
　　5）两组经转染UCNP-PEG@2×PEI-Ce6/siRNA的细胞，其中一组进行980nm激光照射，另一组不照光作为对照试验，Western blotting实验研究siRNA的干扰作用是否受到光动力治疗过程中产生的单线态氧的影响。
　　6）体外细胞毒性试验（MTT）以及荧光显微镜观察calcein-AM&PI双染活死细胞对基因治疗、光动力治疗以及二者联合治疗后细胞生存情况进行分析。
　　结果:
　　1)当N/P比在10以上时，凝胶电泳结果可见UCNP-PEG@2×PEI-Ce6可以明显阻滞siRNA。
　　2）共聚焦显微镜显示UCNP-PEG@2×PEI-Ce6-siRNA成功转染 HeLa细胞，并且在有血清存在的条件下，UCNP-PEG@2×PEI-Ce6-siRNA转染效率更高。
　　3）Western blotting以及RT-qPCR实验结果均表明在有血清存在的条件下，siPlk1对HeLa细胞蛋白表达的沉默作用更大。
　　4）Western blotting实验结果表明光动力治疗过程中产生的单线态氧不会影响 siRNA诱导的基因沉默，为光动力与基因联合治疗奠定基础。
　　5）联合治疗作用下 HeLa细胞生存率明显低于单独光动力治疗或者基因治疗的作用。
　　结论:在组织穿透能力强的近红外光激发下，通过能量共振转移的方式，稀土上转换发光纳米材料的发射光可以作为激发光源激活周围的光敏剂分子，光敏剂分子产生单线态氧杀死异常增殖的癌细胞，从而达到治疗的效果。经近红外光激发的光动力治疗能克服传统光动力疗法中光敏剂难以治疗深层组织的缺点。此外，通过良好的表面修饰，在血清存在的条件下，稀土上转换发光纳米材料仍然具有较高的基因转染效率。最后，稀土上转换发光纳米材料作为一种新兴的多功能纳米载体平台成功用于体外光动力与基因联合治疗。

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前言

第一部分 用于光动力治疗的稀土上转换发光纳米材料的制备及应用初步探究

1 材料和方法

2结果

3讨论

4小结

第二部分 稀土上转换发光纳米材料用于基因转染及近外红光激发的光动力治疗联合基因治疗的研究

1 材料和方法

2结果

3讨论

4小结

结论

参考文献

附图

综述: 稀土上转换发光纳米材料在肿瘤新型疗法中的应用

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