MSCs与去分化MSCs在成骨分化过程中免疫原性上调的研究

摘要

目的：
　　比较间充质干细胞（mesenchymal stemcells,MSCs）与去分化间充质干细胞（De-differentiated mesenchymal stem cells,De-MSCs）的成骨分化潜能，并探究MSCs与De-MSCs在成骨分化过程中免疫原性的改变及其分子机制。
　　方法：
　　用酶消化法从人胎盘中分离得到MSCs，经鉴定后，采用更换培养基的方法诱导得到De-MSCs，并对De-MSCs鉴定后用于实验。
　　（1）比较MSCs与De-MSCs的成骨分化潜能，用CCK8法检测MSCs与De-MSCs成骨诱导7d过程中的增殖效率；MSCs与De-MSCs进行成骨诱导7d后分别得到Ob-MSCs和Re-MSCs，实时荧光定量PCR（q-PCR，SYBR Green法）检测成骨相关基因的表达；ALP染色比较MSCs与De-MSCs成骨分化的效率。
　　（2）采用流式细胞术（FCM）检测MSCs，Ob-MSCs，De-MSCs和Re-MSCs表面协同刺激分子的表达情况；并将4种细胞与T细胞进行共培养，CCK8法检测 T细胞的增殖，检测MSCs与De-MSCs在体外成骨分化过程中免疫原性的改变。
　　（3）将丝裂霉素C处理的MSCs，Ob-MSCs，De-MSCs和Re-MSCs通过皮下植入免疫BALB/c小鼠，免疫5d后，眼眶静脉取外周血，采用FCM检测外周血单核细胞（PBMCs）中免疫细胞群的活化情况；免疫7d后，采用FCM检测小鼠脾脏细胞中免疫细胞群的活化情况，检测MSCs，Ob-MSCs，De-MSCs和Re-MSCs对小鼠的致敏情况。
　　（4）实时定量PCR（q-PCR，Taqman探针法）检测MSCs，Ob-MSCs，De-MSCs和Re-MSCs中与免疫（miR-125b和miR-296）和成骨（miR-20a和miR-29b）相关的micro RNA（miRNA）的表达情况。
　　结果：
　　（1）De-MSCs与MSCs具有相似的细胞形态、干细胞标志与多向分化潜能。CCK8法检测细胞增殖显示出在成骨诱导7d的过程中，De-MSCs较MSCs有更高的增殖效率。q-PCR结果显示Re-MSCs中成骨相关基因BMP2，COL1和Runx2的表达较Ob-MSCs明显增高。ALP染色显示De-MSCs较MSCs具有更强的成骨能力。
　　（2）流式结果显示，MSCs与De-MSCs体外成骨分化的过程中，正性共刺激分子的表达明显增高，负性共刺激分子的表达明显下降，且这种现象在De-MSCs中表现的更加明显。混合淋巴细胞反应（MLR）显示，MSCs与De-MSCs可以抑制T细胞的增殖，但成骨分化后抑制T细胞增殖的程度降低，且Re-MSCs组T细胞的增殖效率高于Ob-MSCs组。
　　（3）PBMCs的流式结果显示，分化的Ob-MSCs和Re-MSCs致敏小鼠后，PBMCs中的T细胞、巨噬细胞、树突状细胞和B细胞的活化效果均要高于相应的未分化的MSCs和De-MSCs致敏的小鼠。同时，Re-MSCs致敏的效果高于Ob-MSCs组。以上现象在脾脏细胞的流式结果中体现的更加明显。
　　（4）miR-20a和miR-29b与成骨有关，而miR-125b与miR-296与免疫调节有关。q-PCR结果显示，miR-20a和miR-125b在MSCs与De-MSCs成骨分化的过程中表达下调，而miR-29b和 miR-296在成骨分化的过程中表达上调，且miRNAs在De-MSCs分化过程中表达下调与上调的幅度均明显高于MSCs。
　　结论：
　　De-MSCs具有与MSCs相似的形态、干细胞标志与多向分化潜能，且与MSCs相比具有更高的成骨分化潜能。MSCs与De-MSCs都具有低免疫原性，但是经体外成骨分化后其免疫原性上调，且De-MSCs上调的程度更高。MSCs与De-MSCs成骨分化过程中免疫原性的上调与miRNA有关。提示De-MSCs可替代MSCs应用于组织工程和再生医学，但需要考虑其在分化过程中免疫原性的改变对移植效果的影响。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

引言

参考文献

第一部分 MSCs与De-MSCs的生物学特性及成骨潜能的比较

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

参考文献

第二部分 MSCs与De-MSCs诱导成骨分化过程中免疫原性的变化

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

参考文献

第三部分 与MSCs和De-MSCs的免疫和成骨相关的miRNA的研究

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

参考文献

总结与展望

全文结论

展望

综述: 去分化的间充质干细胞的研究进展

硕士研究生期间完成的论文

课题资助

中英文对照缩略词表

致谢