家蚕受体酪氨酸激酶样的孤独受体Ror2基因功能的研究

摘要

受体酪氨酸激酶样的孤独受体（The receptor tyrosine kinase-like orphan receptor, Ror）2（Ror2）是受体酪氨酸激酶Ror家族中的一员，属于RTKs家族，在很多细胞形态发生过程中起到了十分重要的作用，包括参与调节细胞增殖、分化、迁移、黏附和死亡等多种细胞功能。在哺乳动物小鼠中，Ror2突变最终导致小鼠面部畸形，四肢和尾部短小，呼吸功能障碍，最终使新生小鼠死亡。在爪蛙中研究发现，XRor2及其突变体干扰了原肠期的汇聚延伸运动。因此，认为Ror2在胚胎早期发育过程中可能发挥了重要作用。Ror2在进化上是非常保守的，从海兔到果蝇到人都有发现了Ror2的同源基因。但是在家蚕这一鳞翅目昆虫模式种中至今还没有报道过。本研究在成功克隆了BmRor2基因的基础上，检测了该基因在家蚕不同组织、不同龄期的表达水平，探讨了过表达BmRor2对培养细胞大小、周期的影响，研究了BmRor2基因过表达对家蚕部分信号通路关键基因的影响。
　　1家蚕Ror基因的克隆及序列分析
　　通过电子克隆获得了家蚕Ror基因的序列。根据电子克隆的序列设计引物进行RT-PCR，克隆测序结果显示，BmRor2的ORF为1924 bp，编码638 aa。该序列在GenBank的登录号为：NP_001186538。结构域分析显示，BmRor2蛋白的二级结构主要为无规卷曲和α螺旋。Ror2蛋白的结构同其他受体酪氨酸激酶的结构类似，含有胞外结构域（类Frizzled（FZ）的胱氨酸结构域）、跨膜结构域、细胞质结构域（含有保守的酪氨酸激酶区和富含丝氨酸、丝氨酸以及脯氨酸的C端结构域）。FZ结构域中的CDR结构域能与Wnt蛋白结合，表明Ror2蛋白具有受体功能Ror2蛋白含有酪氨酸激酶结构域，推测具有激酶活性。
　　2家蚕Ror2的细胞定位及表达谱分析
　　为了进一步分析BmRor2基因在五龄三天家蚕不同组织的转录水平，对头、脂肪体、中肠、马氏管、精巢、卵巢、血细胞、气管丛和丝腺等主要组织中的相对表达水平采用Real-Time PCR进行了检测。结果显示BmRor2在头中转录水平相对较高一些，气管丛、卵巢、马氏管有表达，在脂肪、血细胞和丝腺相对较低，但从总体趋势来说，BmRor2基因在各组织的表达量均不太高。BmRor2在卵巢组织和精巢组织均为在四龄第4天的表达量最高，而其他时期的表达量均比较低。
　　为了探讨BmRor2的表达规律及细胞定位特征制备了BmRor2蛋白的抗体。五龄第3天家蚕主要组织的Western blotting检测结果显示，在头中可以检测到BmRor2蛋白。免疫荧光显示，BmRor2在卵巢来源的BmN细胞中能够表达，且主要分布在细胞膜周围，与其具有受体功能相一致。四龄第四天的家蚕主要组织免疫组化结果显示，BmRor2蛋白在各组织均有表达，且头部表达量最高，与Real-Time PCR、Western blotting结果一致。
　　3转基因通用载体pBGRN的构建
　　为了更高效、更方便的筛选到转基因家蚕，构建了转基因通用载体pBGRN。该载体以piggyBac转座子元件为基本骨架，并克隆了neo、dsRed、和EGFP基因表达元件，其中neo基因由BmNPV来源的启动子ie-1驱动，使转基因家蚕获得G418抗性，在初期可用G418对转基因家蚕进行筛选；dsRed由人工启动子3×P3控制，可使转基因家蚕的红色眼具有红色荧光，可以在胚胎期、蛹期和蛾期进行观察筛选。EGFP使用ie-1来启动，使转基因家蚕具有绿色荧光，可以在孵化前和蛹期进行观察筛选。因此构建的转基因通用载体含有多重筛选基因，可以更方便高效的筛选得到转基因家蚕。
　　4调节BmRor2基因的表达量对细胞大小和周期的影响
　　为了探讨构建的转基因通用载体pBGRN的实用性，构建了过表达家蚕Ror2基因的重组载体PBGRN-Ror2。该载体转染家蚕卵巢细胞，48 h后就能观察到绿色荧光细胞，进一步通过G418连续筛选获得了过表达家蚕Ror2基因的转化细胞系。通过定量PCR检测BmRor2基因的表达水平，发现其上调5.14倍。说明所构建的转基因通用载体pBGRN可以使用，而且可以方便地获取转化家蚕细胞系。
　　为了探讨Ror2基因的功能，通过定量PCR研究了过表达Ror2基因以及下调Ror2基因对家蚕部分信号通路中一些关键基因表达水平的影响。结果显示，过表达BmRor2基因后，wnt、socs6、stat、pr基因没有明显的变化，socs2基因的表达量较BmN细胞上调1.56倍，crb、wts、cat、fj、dpp、kibra、serr、myc基因的表达量较BmN细胞都发生了下调。下调Ror2基因后，dpp基因上调了1.88倍，stat、socs2、
　　socs6基因没有明显变化，crb、wts、cat、fj、kibra、myc也发生了下调。并且过表达Ror2基因的BmN细胞体积有所减小，增殖速度变慢。说明家蚕的Ror2基因对细胞大小有调节作用。

目录

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目录

第一章 文献综述

1 Ror蛋白的概述

2 Ror2蛋白的结构

3 Ror2的功能

4 家蚕

参考文献

第二章 研究目的与研究内容

1 研究目的和意义

2 研究的主要内容

3 技术路线

第三章 家蚕Ror2基因的克隆及序列分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

第四章 家蚕Ror2的细胞定位及表达谱分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

第五章 转基因通用载体pBGRN的构建

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

第六章 BmRor2表达量对细胞大小和增殖的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

结论

在校期间发表论文情况

附录

致谢