锌指转录因子Sp7/Osterix在斑马鱼骨骼发育中的重要作用

摘要

成骨细胞的分化是一个多步骤的过程，包括间充质细胞分化为骨细胞等一系列的成骨细胞谱系。SP7/OSTERIX作为一个成骨细胞特异性的转录因子，在前成骨细胞向成熟的成骨细胞及骨细胞分化的过程起到了重要的作用。脊椎动物SP7是非常保守的基因，其蛋白质结构中起重要作用的三个锌指结构的氨基酸序列在人类、小鼠和斑马鱼中几乎没有差别。人类SP7基因的点突变可导致成骨发育不全症,说明SP7对人类骨骼发育的重要性。因为Sp7敲除小鼠出生后15分钟即死亡，目前对于Sp7的研究只能局限于成骨细胞系或者Sp7条件性敲除的小鼠，尚不能研究Sp7在整个小鼠发育过程中的作用。
　　斑马鱼（Danio rerio）作为一种模式生物已经被广泛的应用于遗传学、发育生物学等研究。我们运用最近几年才发展起来的基因敲除技术TALEN建立了sp7的斑马鱼纯合突变体。我们发现该突变体可以存活至少1年的时间。通过茜素红染色发现这些突变体成鱼表现出尾鳍弯曲、鳃盖缺失、上颌骨缺失及整体的体长体重显著减少等表型。Micro-CT分析发现sp7突变体表现出骨量减少，头骨愈合不全，脊柱与锥弓弯曲，椎体与椎体之间有缝隙等表型。通过对突变体幼鱼的硬骨和软骨染色表明：突变体的硬骨中包括头骨部分、脊柱部分以及鳍部都表现出不同程度的缺损，而软骨部分几乎没有差别。这些结果表明Sp7对斑马鱼硬骨发育必不可少。荧光定量分析发现相较于野生型，sp7突变体的硬骨标记基因osteocalcin、spp1、phex、colla1a和sost显著性地下调，而软骨的标记基因sox9a和sox9b没有表现出显著性的差异。
　　col10a1是X型胶原蛋白，在小鼠中其仅对软骨发育起作用，但是在斑马鱼中的原位杂交实验展示了其也在硬骨中表达，并且在sp7突变体中其表达量及表达部位的形态显著改变，同时定量结果也显示其在突变体中显著下调。我们分析了斑马鱼的col10a1启动子，发现其拥有类似的被Sp7蛋白质绑定的位点Sp1位点。进一步通过细胞实验及体内ChIP实验发现Sp7的确是通过绑定col10a1启动子上的Sp1位点启动col10a1的表达。我们将sp7的mRNA注射到突变体中，通过对col10a1这个基因进行了定量和原位分析发现其表达可以在一定程度上恢复。这些结果表明Sp7直接调节col10a1。
　　该研究利用TALEN技术建立了稳定遗传的sp7突变体斑马鱼模型，为研究骨骼发育及筛选用于治疗人类成骨不全症的药物提供了宝贵研究材料。本研究展示了X型胶原蛋白Col10a1在硬骨发育中也起到了一定的作用，并且发现它是Sp7新的下游基因进而丰富了成骨细胞分化的分子机制。

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第一章 文献综述

1.1脊椎动物的骨骼发育

1.2 转录因子Sp7对于骨骼发育是必不可少的

1.3 SP7的突变与人类骨骼疾病的关系

1.4 斑马鱼作为模式动物的优势

1.5研究思路及意义

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验仪器

2.3实验试剂

2.4常用试剂配制

2.5引物及注射用Oligo序列

2.6实验方法及设计

第三章 实验结果与分析

3.1在斑马鱼中，Sp7 蛋白功能域具有很强的保守性

3.2在斑马鱼中，通过TALEN手段敲除sp7基因

3.3在幼鱼时期经过茜红素染色发现其头骨有明显缺陷

3.4成年斑马鱼表现为同样的表型

3.5 q-RT-PCR结果显示了其下游基因有着明显的下调

3.6发现了一个sp7的新的下游基因col10a1

3.7显微注射sp7 的mRNA可以拯救col10a1表达

第四章 结 论

本研究得到以下结果

第五章 讨论与展望

5.1运用斑马鱼来研究sp7的功能

5.2运用该斑马鱼中的sp7突变体来研究人类骨骼疾病

5.3运用该模型来筛药

5.4该模型还可以用来研究其它方面

5.5关于Sp7与胶原蛋白的关系

5.6 micro-CT在斑马鱼骨骼发育中的应用

参考文献

附录

研究生期间已发表和待发表的论文

致谢