miR-34a通过调控N-myc表达抑制MDSCs凋亡的研究

摘要

microRNAs(miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20～25个核苷酸。近年来研究表明miRNAs在生物学的各个过程中发挥了极其重要的作用:如细胞和个体发育、器官形成、造血生成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢、细菌与病毒的感染和机体防御、炎症的发生发展等。同样，microRNAs在免疫系统中亦有很好的研究。已有的研究表明microRNAs在T细胞、B细胞、DC、NK细胞分化发育中均发挥重要作用，从而参与了机体先天免疫和获得性免疫应答。Rafael Casellas实验室的研究结果表明miR-34a在各种免疫细胞中呈现出不同的表达水平，由此我们推测miR-34a可能在淋巴细胞的分化发育中发挥重要作用。为进一步探讨miR-34a在淋巴细胞分化发育中的作用，在本课题中，我们主要通过建立miR-34a嵌合小鼠模型和miR-34a转基因小鼠模型并应用这两种动物模型来探讨miR-34a在淋巴细胞分化发育中的作用。首先，我们构建了miR-34a过表达质粒pMDH1-PGK-GFP-miR-34a，并通过qPCR、流式分析等验证了miR-34a过表达质粒pMDH1-PGK-GFP-miR-34a的成功表达，在此基础上，我们一方面制备了miR-34a的逆转录病毒，感染小鼠的骨髓干细胞，建立了miR-34a的嵌合小鼠模型，通过PCR及FACS验证了小鼠模型的成功构建;另一方面，我们将pMDH1-PGK-GFP-miR-34a用HindⅢ酶切线性化，经显微注射到受精卵细胞中制备了miR-34a转基因小鼠模型。经FACS分析发现:无论在嵌合小鼠中，还是在转基因小鼠模型中，过表达了miR-34a后，无论是在骨髓还是在脾脏中，B细胞的数目均有显著减少，此结果与Baltimore实验室研究结果一致，进一步说明了嵌合小鼠模型和转基因小鼠模型的构建成功。进一步研究发现，过表达miR-34a后，无论是在嵌合模型还是在转基因模型中，髓系来源的抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)都显著高于其在正常小鼠体内的比例，且在转基因小鼠模型中发现MDSCs的绝对数升高。通过BrdU染色研究发现BM和脾脏中BrdU阳性细胞比例未见显著差异，这一结果提示miR-34a并不影响MDSCs细胞的自我更新或增殖。进一步分析MDPs等早期分化祖细胞发现:和WT小鼠比较，MDPs，GMPs等祖细胞比例未发现有显著差异，但用AnnexinⅤ染色，经FACS检测发现，转基因小鼠的MDSCs的凋亡明显减少，这提示着miR-34a很可能是通过减少MDSCs的凋亡而使其百分比和绝对数增高。为进一步分析miR-34a抑制MDSCs凋亡的作用机制，寻找miR-34a在MDSCs中的靶基因，我们应用miRWalk软件预测、荧光素酶报告系统检测以及实时定量PCR及Western-blot等研究发现，miR-34a可能通过作用于N-myc等来调控MDSCs的发育。
　　为进一步探讨miR-34a是否影响MDSCs的功能，我们应用流式细胞仪分选MDSCs，并应用实时定量PCR检测发现:和WT MDSCs相比，脾脏中miR-34a过表达的MDSCs产生高水平的TNF、iNOS、IL-17，而Arg、TGF-β的表达较低。但在BM MDSCs中miR-34a过表达后TNF、iNOS、IL-6、IL-10、IL-12等表达较高。为验证这种细胞因子表达谱的变化是否影响MDSCs的功能，我们分别在miR-34a和WT小鼠中建立LLC小鼠模型，发现两组肿瘤生长并无显著差异。考虑到miR-34a同样在其他细胞中过表达，为排除其他细胞的影响，我们从miR-34a转基因模型中纯化BM MDSCs并在肿瘤注射前通过眼静脉方式注射到小鼠体内，和WT MDSCs输注组相比，miR-34a MDSCs并未显著影响LLC肿瘤在体内的生长。这些结果提示尽管miR-34a改变了MDSCs细胞因子的表达谱，但并未影响MDSCs对肿瘤生长的影响。
　　总结我们现有研究，我们成功建立了miR-34a过表达嵌合小鼠和转基因小鼠动物模型，通过研究发现，miR-34a通过抑制N-myc等分子的表达从而抑制了MDSCs的凋亡，尽管miR-34a过表达后影响了MDSCs的细胞因子的表达谱，但并不影响MDSCs对肿瘤的生长。这一系列的研究一方面揭示了miR-34a对MDSCs分化发育及凋亡等的影响，同时，也为microRNAs在淋巴细胞的生物学行为影响提供新的依据。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 miR-34a小鼠表型的分析

材料和方法

一、实验材料

二、实验方法

实验结果

一、miR-34a过表达骨髓嵌合小鼠模型的表型分析

二、miR-34a过表达转基因小鼠模型的表型分析

三、miR-34a对淋巴细胞的增殖及凋亡的影响

四、miR-34a对CMP、GMP发育的影响

讨论

第二部分 miR-34a的靶基因分析及验证

材料和方法

一、实验材料

二、实验方法

实验结果

一、miR-34a靶基因的生物学预测

二、miR-34a报告质粒的构建

三、N-myc是否是miR-34a在MDSCs发育过程中靶基因的验证

讨论

第三部分 miR-34a对MDSCs功能的研究

材料和方法

一、实验材料

二、实验方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

综述 microRNA对MDSCs分化发育的调控

硕士期间完成的论文

附录

致谢