壳聚糖/丝素共混凝胶及其作为骨髓间充质干细胞培养支架的初步研究

摘要

内部呈三维网络结构的高分子水凝胶具备较大的孔隙率，保水性强，力学性能与脂肪组织相近，是最有可能用作脂肪组织工程支架的一类材料。本文用壳聚糖与丝素蛋白共混，通过β-甘油磷酸钠的诱导，制备可在较短时间内形成的壳聚糖/丝素共混凝胶，利用丝素蛋白对细胞的亲和性提高壳聚糖凝胶对细胞的黏附和引导生长能力。研究凝胶中壳聚糖/丝素比例的改变对凝胶孔结构、粘弹性、抗压强度的影响。并从SD大鼠活体内分离得到骨髓间充质干细胞（BMSCs），经CD34、CD90鉴定和地塞米松诱导分化成脂肪细胞，确认其干细胞的生物学特性后，接种于壳聚糖/丝素共混凝胶内，经体外培养，初步研究用壳聚糖和丝素共混后，形成的凝胶对细胞黏附和生长的影响。
　　首先，本文制备了不同质量比的壳聚糖/丝素共混凝胶，研究壳聚糖/丝素共混比对凝胶化时间、凝胶内部孔结构、凝胶的粘弹性和抗压强度的影响。结果表明，壳聚糖和丝素蛋白混合溶液在β-甘油磷酸钠的诱导下，可在较短时间内转变成共混凝胶。壳聚糖/丝素比例为75/25及50/50时，凝胶化时间分别为15min和25min。壳聚糖/丝素共混比为75/25、50/50、25/75的凝胶内部的平均孔径分别为96.58μm、118.26μm和132.67μm，丝素所占的比例较大的凝胶内部的孔径较大。压缩性能和粘弹性测试结果表明，壳聚糖/丝素共混凝胶具有弹性材料的力学性能，当壳聚糖/丝素共混比为75/25时，凝胶显示出较大的抗压强度。
　　其次，分离获得大鼠的BMSCs，进行CD34、CD90鉴定，并向成脂肪细胞的诱导分化。CD34、CD90鉴定结果证明，采用本文所述方法成功地分离获得了大鼠的BMSCs。获得的BMSCs成漩涡状生长，形态均一，细胞排列紧密且细胞生长至第6-7天时，细胞融合度达到80-90％。BMSCs经地塞米松的诱导后，经油红O染色鉴定证明，可分化为脂肪细胞。
　　再次，将大鼠的BMSCs接种于壳聚糖/丝素共混凝胶内，初步研究了用壳聚糖/丝素共混后形成的凝胶对细胞黏附和生长的影响。体外培养后经激光共聚焦显微镜和扫描电子显微镜观察结果表明，与不含丝素的壳聚糖凝胶相比，细胞在共混比为75/25和50/50的壳聚糖/丝素凝胶内的存活能力明显增强，细胞伪足伸展和铺展速率更快，且能分泌细胞外基质。说明通过与丝素蛋白的共混，可明显改善细胞在壳聚糖凝胶内的黏附和生长微环境。

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第一章 引 言

1.1 脂肪组织工程

1.2 种子细胞的选择

1.3水凝胶及其作为组织工程支架的研究

1.4 本文研究的目的与主要内容

第二章 壳聚糖/丝素共混凝胶的制备

2.1材料与方法

2.2 结果与讨论

2.3 本章小结

第三章 大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养、鉴定和诱导分化成脂肪细胞

3.1 材料与方法

3.2 结果与讨论

3.3 本章小结

第四章 骨髓间充质干细胞在壳聚糖/丝素共混凝胶内的生长

4.1 材料与方法

4.2 结果与讨论

4.3 本章小结

第五章 结 语

5.1 全文结论

5.2 本文的主要研究成果

5.3 今后进一步的研究计划

5.4 本文的不足之处

参考文献

攻读硕士期间本人出版或公开发表的论著、论文

致谢