负性共刺激分子PD-L1在卵巢癌免疫逃逸中的作用及其机制

摘要

卵巢癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，发生机制及病因学尚未明确。近年来，随着肿瘤微环境在癌症发生和发展认识的加深，人们对于卵巢癌免疫逃逸机制的探讨成为该领域前沿课题。作为肿瘤免疫效应阶段的执行场所，肿瘤微环境内存在许多因素参与肿瘤组织与免疫系统的相互作用，包括局部效应细胞功能障碍、抑制性免疫细胞和细胞因子的负调节作用、抑制性配体受体反应以及肿瘤微环境中T细胞代谢活性的负调节等。
　　研究显示，作为重要的一组参与免疫逃逸的B7家族负性共刺激分子在癌组织中表达是肿瘤微环境中极为重要的一个特征，其中，PD-L1是近年来备受关注的负性免疫分子，称之为免疫卡控点（Immune Checkpoint），其通过抑制T细胞的增殖、细胞因子的分泌和促进T细胞的凋亡负性调控T细胞的免疫应答，在肿瘤免疫逃逸过程发挥着极为重要的作用。
　　本文以免疫卡控点分子PD-L1为靶分子，以肿瘤微环境为切入点，借助组织学、细胞生物学、免疫学、动物学手段，探讨该分子介导卵巢癌的免疫逃逸的作用及机制。
　　论文第一部分采用免疫组织化学方法检测了人卵巢癌组织中 PD-L1分子的表达（n=81），分析其和浸润肿瘤相关巨噬细胞（TAM）、CD8+T细胞、细胞增殖抗原 Ki-67的相关性。结果显示：①卵巢癌组织 PD-L1分子的表达可分为胞膜为主型（9/81，11.11％），胞浆为主型（32/81，39.50％），胞膜胞浆混合型（13/81，16.05％），胞膜胞浆低/不表达型（27/81，33.33％）；②癌细胞不同部位 PD-L1表达水平与FIGO分期和病理类型均无关（P>0.05），但低分化组癌细胞膜上PD-L1分子的表达高于中低分化组（P<0.05）；③在癌细胞胞浆PD-L1低/不表达组和中/高表达组CD8+T淋巴细胞浸润程度有差异（P<0.05），在癌细胞胞膜低/不表达组和中/高表达组中CD68+细胞浸润程度有差异（P<0.05）。
　　论文第二部分探讨了PD-L1分子在卵巢癌细胞上的表达及其意义。首先通过小分子干扰RNA（siRNA）干扰卵巢癌细胞株中PD-L1分子的表达来观察该分子在肿瘤增殖、侵袭中所发挥的作用，并进一步验证卵巢癌细胞 PD-L1分子介导的T细胞凋亡作用，进而在卵巢癌模型中评价干预 PD-L1信号的免疫治疗价值。结果显示：①干扰卵巢癌细胞中 PD-L1分子后肿瘤细胞的增殖受到抑制，侵袭能力明显下降；②在肿瘤相关巨噬细胞诱导下卵巢癌细胞膜上上调表达的PD-L1分子能促进CD8+T细胞的凋亡，采用PD-L1单抗能阻断上述效应；③建立小鼠卵巢癌ID8模型，成瘤小鼠肿瘤组织和脾脏中CD8+T细胞均存在P D-1分子的表达，分别采用阻断型PD-L1单抗和阻断型PD-1单抗进行免疫治疗，和对照组相比，抗体治疗组均能明显控制肿瘤生长，且伴有脾脏中C D8+T细胞上P D-1分子的表达下调。
　　论文第三部分探讨卵巢癌细胞上 PD-L1分子的表达及其可能的调节机制。结果显示：①体外培养的SKOV3细胞中存在PD-L1分子mRNA的表达，但其蛋白质水平的表达不位于膜表面，而是在胞内，体内成瘤过程能上调 SKOV3细胞膜PD-L1分子的表达；②胞内细胞因子染色检测结果表明，卵巢癌组织来源的肿瘤相关巨噬细胞（TAM）可分泌IL-6、IL-10、TNF-?、IFN-?。免疫组化结果亦证实癌组织中IL-6、IL-10、TNF-?、IFN-?的表达水平均高于卵巢良性疾病组织；③进而观察了TAM及相关细胞因子对卵巢癌细胞表面P D-L1的调节作用。结果显示，采用TAM上清及相关因子IL-6、IL-10、TNF-?、IFN-?培养SKOV3细胞96 h后，SKOV3细胞膜表面PD-L1分子的表达明显上调。Western blot和real-time PCR分析显示，不同细胞因子刺激下 SKOV3细胞 PD-L1分子表达的增加在于总蛋白表达水平增加，而并非在于转录水平的改变；④Western blot分析显示，TNF-α、IFN-γ刺激SKOV3细胞15 min后ERK1/2的磷酸化、AKT的磷酸化明显增加，不伴有STAT3磷酸化的增加；IL-6、IL-10刺激SKOV3细胞不能促进ERK1/2的磷酸化和AKT的磷酸化，但IL-6可上调STAT3的磷酸化。⑤采用化学阻滞剂封闭AKT信号后，IFN-γ介导SKOV3细胞膜表面表达PD-L1分子效应部分阻断。采用化学阻滞剂封闭ERK信号后，TNF-α介导SKOV3细胞膜表面表达PD-L1分子效应部分阻断；封闭AKT信号和ERK信号不影响IL-10、IL-6上调SKOV3细胞膜上PD-L1分子表达的效应；STAT3抑制剂 AG490也不影响 IL-6、IL-10上调SKOV3细胞膜上PD-L1分子表达的作用。
　　论文第四部分将在卵巢癌中分析一群以表达 PD-L1分子为特征的肿瘤相关巨噬细胞，探讨其生物学特征和临床检测意义。研究结果发现：①卵巢癌组织浸润巨噬细胞较卵巢囊肿浸润巨噬细胞更高水平表达 PD-L1分子。在卵巢癌患者外周血，存在一群以表达PD-L1分子为特征的巨噬细胞，III-IV期卵巢癌患者外周血中这群细胞的含量高于I-II期患者（P<0.05）；②进一步的分析显示，和PD-L1分子表达阴性的巨噬细胞相比，P D-L1分子表达阳性的巨噬细胞的细胞因子分泌有不同的特点，提示这可能构成一群独立的巨噬细胞亚群，在卵巢癌发展过程中发挥重要作用的细胞亚群。
　　综上，卵巢癌以不同程度和方式表达PD-L1分子，胞膜上出现PD-L1分子的表达也伴随着癌细胞恶性程度的增加，PD-L1分子的表达也和浸润肿瘤相关巨噬细胞、CD8+T细胞、核增殖抗原存在相关；肿瘤微环境能介导卵巢癌细胞膜上PD-L1分子表达的上调，而不影响胞浆中PD-L1分子的表达，也不影响其mRNA水平，其中，肿瘤相关巨噬细胞来源的多种细胞因子发挥重要作用，涉及到了AK T、ERK1/2信号；卵巢癌细胞胞浆中PD-L1分子的表达具有功能性，可维系肿瘤细胞的增殖和侵袭，膜表面PD-L1分子的表达则发挥抑T细胞活性的作用；采用PD-L1、PD-1单抗均可在卵巢癌荷瘤模型中发挥抗肿瘤作用。此外，PD-L1分子还可通过肿瘤相关细胞进一步介导免疫逃逸，以表达 PD-L1分子为特征的肿瘤相关巨噬细胞在疾病的发展中具有重要意义。

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研究背景

一、卵巢癌组织学特点

二、卵巢癌和肿瘤免疫

三、PD-L1分子及其功能

四、结语

参考文献

第一部分 PD-L1及相关分子在卵巢癌组织中的表达特点及其意义

一、材料与方法

二、结果

三、讨 论

参考文献

第二部分 PD-L1分子在卵巢癌细胞上的表达及其生物学意义

一、材料与方法

二、结 果

三、讨 论

参考文献

第三部分 卵巢癌细胞上PD-L1分子表达的调节因素

一、材料与方法

二、结 果

三、讨 论

参考文献

第四部分 卵巢癌肿瘤相关巨噬细胞上PD-L1分子的表达及其意义

一、材料与方法

二、结 果

三、讨 论

参考文献

小结和展望

攻读学位期间公开发表的论文

学术交流

本研究所获的基金资助

缩略词表

致谢