FBW7、MCL1在肺腺癌紫杉醇耐药性中的表达差异及作用

摘要

肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，也是目前全世界发病率和死亡率最高的癌症之一。据国家卫生部公布的《全国第三次死因调查》报告[1],肺癌已替代肝癌成为我国恶性肿瘤死亡原因第一位(约占全部恶性肿瘤致死的22.7％)。目前治疗肺癌的手段仍以手术、化疗和放疗为主。肺癌包括了非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）和小细胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）两大类，而占肺癌80%的非小细胞肺癌的患者中[2]，有65%-80%的NSCLC患者确诊时已属局部晚期或发生远处转移，错失手术机会，因此放、化疗是晚期 NSCLC患者的主要治疗手段。其中紫杉醇类药物不仅可与铂类药物联用作为一线治疗，更值得关注的是，多西紫杉醇被认为是非小细胞肺癌二线治疗的金标准。然而耐药的产生极大地限制了其临床疗效。因此，要想进一步改善患者的生存期和生活质量，一方面，需要提高紫杉醇类药物的敏感性，探索其药物效应预测因子，实现个体化治疗，最大限度地避免耐药；另一方面，不断探索新的治疗靶点亦是NSCLC治疗的主要方向。紫杉醇（paclitaxel,PTX）是从植物红豆杉的叶子中提取到的碱性物质，研究表明PTX有很好的抗肿瘤药理活性，但是PTX耐药的产生限制了其临床应用。髓细胞白血病基因-1(myeloid cell leukemia-1，MCL1)是Bcl-2家族的一个新成员，在凋亡调控中具有重要作用[3]，F-盒和含蛋白7的WD重复结构域(F-box and WD repeat domain-containing protein7,FBW7)是一种肿瘤抑制蛋白，其基因突变或表达降低可造成多种肿瘤的发生[4]，本文通过检测肺癌细胞A549及A549/T中FBW7和MCL1的蛋白质水平和mRNA水平与紫杉醇类药物敏感性的关系，探讨FBW7和MCL1作为紫杉醇类药物效应预测因子的潜在价值，为临床个体化治疗提供指引。
　　目的：
　　观察PTX作用于人肺腺癌A549细胞和A549/T细胞后，对细胞增殖的影响，以及MCL1和FBW7蛋白和mRNA的表达水平，来研究PTX抑制肺癌增殖以及耐药的相关机制。
　　方法
　　1、PTX对细胞增殖的影响：不同浓度的PTX作用于人肺腺癌A549和A549/T两种细胞于不同的时间，应用MTT法检测细胞的增殖抑制率。
　　2、PTX对A549及A549/T两种细胞中MCL1、FBW7mRNA表达的影响：不同浓度PTX作用 A549及A549/T两种细胞后，通过实时荧光PCR（Quantitative real-time PCR, q PCR）来检测A549及A549/T两种细胞中MCL1、FBW7的mRNA表达。
　　3、比较A549及A549/T细胞中MCL1、FBW7蛋白表达情况：通过采用MCL1、FBW7抗体进行细胞免疫组化技术，检测A549及A549/T两种细胞中MCL1、FBW7蛋白表达。
　　4、PTX对A549及A549/T两种细胞中MCL1、FBW7蛋白表达的影响：不同浓度的PTX作用于A549及A549/T两种细胞后，应用蛋白质印迹法检测MCL1、FBW7蛋白的表达。
　　结果
　　1、PTX对细胞增殖的影响：不同时间、不同浓度PTX作用A549及A549/T两种细胞后，能抑制细胞的增殖，且呈时间-浓度依赖性（P＜0.05），但是耐药细胞A549/T的药物浓度明显高于不耐药细胞A549的。
　　2、PTX对A549及A549/T两种细胞中MCL1、FBW7mRNA表达的影响：不同浓度PTX作用 A549及A549/T两种细胞后，q PCR显示A549 MCL1mRNA表达下调，FBW7mRNA表达上调，而耐药细胞对此浓度无明显变化。
　　3、比较A549及A549/T细胞中MCL1、FBW7蛋白表达情况：应用细胞免疫组化技术，检测出A549细胞中MCL1蛋白的表达低于及A549/T细胞的，而A549细胞中FBW7蛋白的表达高于A549/T。
　　4、PTX对A549及A549/T两种细胞中MCL1、FBW7蛋白表达的影响：不同浓度的PTX作用于A549及A549/T两种细胞后，western显示A549细胞中MCL1蛋白表达下调，FBW7蛋白表达上调，耐药细胞对此浓度无明显变化。
　　结论
　　1、PTX能抑制人肺腺癌A549及A549/T细胞的增殖,但对于A549/T细胞所需要的紫杉醇浓度显著高于A549细胞的。
　　2、不同浓度PTX作用于A549细胞后，FBW7表达上调，而MCL1表达下调，但相同的浓度作用于A49/T细胞后FBW7及MCL1的表达无明显变化。
　　3、在耐紫杉醇的细胞中FBW7表达下降而Mcl-1高表达，这提示与紫杉醇的耐药可能有关，但具体机制有待进一步研究。

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前言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3实验结果

3.1 A549及A549/T细胞对紫杉醇的体外敏感性不同

3.2 PTX对A549及A549/T两种细胞中MCL1、FBW7mRNA表达的影响

3.3比较A549及A549/T细胞中MCL1、FBW7蛋白表达情况

3.4 PTX调节MCL1、FBW7蛋白的表达

4讨论

5结论

参考文献

附录: 紫杉醇耐药的研究进展

主要缩略词表

攻读学位期间发表的学术论文

致谢