激酶类抑制剂对紫杉醇羟化途径的选择性抑制以及药物相互作用研究

摘要

目的：
　　紫杉醇在临床上常与小分子激酶类抑制剂联用以增强抗肿瘤效果，而大多数激酶类抑制剂对代谢酶有抑制作用，可能引起药物之间的相互作用。本文以此为研究背景，考察12个小分子激酶类抑制剂在体外人肝微粒体中，对CYP2C8和CYP3A4介导的紫杉醇羟基化代谢途径的抑制，并鉴别激酶类抑制剂对紫杉醇羟化代谢途径的抑制选择性。通过分子对接和光谱分析模拟激酶类抑制剂与酶蛋白的结合，应用数学模型预测药物相互作用的机制与程度。
　　方法：
　　首先建立同时检测紫杉醇两个代谢物6α-羟基紫杉醇和p-3’羟基紫杉醇的LC-MS/MS定量分析方法；建立并优化紫杉醇在体外人肝微粒体中代谢孵育体系，并同时监测激酶类抑制剂对紫杉醇两条代谢途径的抑制作用，获得12个激酶类抑制剂对CYP2C8和CYP3A4代谢途径的可逆性抑制参数Ki，以及阿西替尼时间依赖性抑制常数KI和 kinact。通过使用谷胱甘肽捕获阿西替尼氧化反应的中间体，以超高效液相色谱–紫外–四级杆飞行时间质谱法（UPLC-UV/Q-TOF MS）检测反应体系中谷胱甘肽加合物。使用分子对接模型模拟抑制剂与酶蛋白的结合，获得对接Glide分值，考察该分值与抑制实验中获得的抑制常数Ki的相关性。通过P450吸收光谱分析，考察抑制剂与酶蛋白结合类型，分析抑制剂与酶蛋白结合紧密程度与其抑制常数之间的相关性。以抑制常数和紫杉醇体内外代谢份数为主要参数，运用数学模型预测紫杉醇与激酶类抑制剂联用时的药物相互作用程度。
　　结果：
　　12个小分子激酶类抑制剂对紫杉醇羟基化代谢有不同程度的抑制作用，其中尼洛替尼对CYP2C8和CYP3A4代谢途径均有较强的可逆性抑制作用，Ki值分别为0.1和0.28μM。阿西替尼，拉帕替尼，尼洛替尼和索拉非尼选择性地抑制CYP2C8介导的紫杉醇的羟基化代谢；而博舒替尼，达沙替尼，厄洛替尼，帕唑帕尼和舒尼替尼选择性地抑制CYP3A4介导的紫杉醇的羟基化代谢。阿法替尼，吉非替尼和伊马替尼对紫杉醇两条羟基化代谢抑制强度相当。此外，阿法替尼，厄洛替尼，吉非替尼，拉帕替尼和索拉非尼对CYP2C8代谢途径有中等程度的时间依赖性抑制作用，而除索拉非尼以外的其他激酶类抑制剂对CYP3A4代谢途径有较强的时间依赖性抑制作用。阿西替尼对CYP3A4酶介导的紫杉醇羟基化代谢途径有较强的时间依赖性抑制作用，动力学参数KI和kinact分别为0.93μM和0.0137 min-1。用捕获剂GSH捕获到阿西替尼氧化中间体，说明氧化活化是产生时间依赖性抑制的原因。分子对接模拟分析发现，尼洛替尼可通过多个氢键和范德华作用力与酶蛋白氨基酸残基紧密结合，而舒尼替尼与酶蛋白氨基酸残基的作用力相对较弱。实验获得的CYP3A4 Glide对接分值与抑制实验获得的Ki值有较好的线性相关性（r2=0.64），而CYP2C8 Glide对接分值与抑制实验获得的Ki值线性相关性较弱（r2=0.51）。光谱分析实验结果显示，大多数具有较强酶抑制作用的激酶类抑制剂与CYP2C8和CYP3A4的结合表现为II型光谱。与此结果相比较，尽管博舒替尼作为CYP2C8的强抑制剂，但其与CYP2C8的结合并未表现为II型光谱。光谱实验获得的抑制剂与CYP2C8（r2=0.950）和CYP3A4（r2=0.807）酶光谱解离常数Ks和可逆性抑制参数Ki有较好的线性相关性。数学模型模拟预测药物相互作用结果显示，紫杉醇肝摄取率的引入大大提高了预测结果的准确性。相反，时间依赖性抑制参数的引入会高估紫杉醇与激酶类抑制剂的药物相互作用，该高估现象与紫杉醇CYP3A4代谢途径的代谢份数相关。
　　结论：
　　本课题研究发现激酶类抑制剂对紫杉醇羟化代谢途径的抑制有选择性，并且大部分激酶类抑制剂对CYP3A4介导的代谢有时间依赖性抑制作用。分子对接模型模拟显示尼洛替尼分子与CYP2C8和CYP3A4酶蛋白氨基酸残基有较强的结合作用，该结果与体外抑制实验数据一致。光谱分析显示大部分激酶类抑制剂与酶蛋白结合表现为II型光谱。数学模型模拟预测显示紫杉醇肝摄取率的引入大大提高了预测结果的准确性。
　　本研究系统地考察了12种激酶类抑制剂对紫杉醇代谢的抑制机制及强度；分子对接模型、P450吸收光谱分析、数学模型模拟结果提示紫杉醇和激酶类抑制剂联用时由代谢酶抑制引起的药物相互作用值得关注，进一步研究将有利于更好地指导临床合理用药、开发安全有效的治疗方案。

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第一章 文献综述

1.1 紫杉醇的代谢和药物动力学

1.2 激酶类抑制剂抗肿瘤药物的结构与性质

1.3 药物相互作用的研究方法

1.4 研究目的与计划

第二章 紫杉醇人肝微粒体中的酶促动力学研究

2.1 实验目的

2.2 实验部分

2.3 结果与讨论

2.4 结论

第三章 激酶类抑制剂对紫杉醇体外代谢抑制类型的研究

3.1 实验目的

3.2 实验部分

3.3 结果与讨论

3.4 结论

第四章 阿西替尼对紫杉醇代谢的时间依赖性抑制机制的研究

4.1 实验目的

4.2 实验部分

4.3 结果与讨论

4.4 结论

第五章 激酶类抑制剂对紫杉醇代谢抑制机制的研究

5.1 实验目的

5.2 实验部分

5.3 结果与讨论

5.4 结论

第六章 数学模型模拟预测激酶类抑制剂与紫杉醇的药物相互作用

6.1 实验目的

6.2 实验部分

6.3 结果与讨论

6.4 结论

第七章 全文总结

参考文献

个人简历

缩略语说明

致谢