基于氨基酸的聚氨酯刺激响应性纳米载体用于抗癌药物的控制释放

摘要

近些年来，聚合物纳米粒子被认为是一项很有前景的科技用于抗癌药物的靶向传递与控制释放。这些纳米粒子具备在体内循环中稳定，而在肿瘤组织或细胞中可快速释放药物的特质。聚氨酯是一种重要的多功能材料，在生物医用领域有广泛的应用。因其优异的物理性能和生物相容性，传统的聚氨酯作为生物稳定性材料，被广泛应用于制造心脏瓣膜、导尿管、人造血管，假肢等植入性设备。生物可降解聚氨酯由于其优良的可降解性，近年来被应用于药物释放和组织工程等领域。目前报道的用于药物传递方面的生物可降解聚氨酯材料，大多是含有酯键，碳酸酯键等可降解基团，在生理环境下它们的降解速度比较慢。为了进一步加快药物在肿瘤组织或者细胞内的释放，研究者在聚氨酯的合成中引入了含有酸不稳定的基团或是还原敏感可断裂的双硫键。目前用于合成还原响应性聚氨酯的含双硫键单体主要是采用2,2'-硫代二乙醇，这将可能导致一定的细胞毒性。因此，本论文目的是制备具有生物相容性和生物可降解性的聚氨酯纳米载体，其在细胞外环境中稳定，而在细胞质中可快速释放药物。本论文设计合成了基于氨基酸的二醇单体，制备了基于氨基酸的还原可降解聚氨酯，制备了刺激响应的胶束，并用于小分子抗癌药物(DOX)的细胞内高效快速释放。进一步表面修饰靶向配体c(RGDfK)，有效地提高了肿瘤细胞的摄取，并增强了药效。而修饰有组胺(Histamine)的载药胶束则表现出了明显的内涵体逃逸以及快速的药物释放性能。
　　论文第一章主要对刺激响应性纳米载体，聚氨酯和基于聚氨酯的纳米药物载体作了简要概述。
　　论文第二章设计合成了新型的基于α-氨基酸还原可降解的聚氨酯，并将其用于制备抗癌药物的控制释放载体。首先通过3,3'-硫代二丙酸(DTDPA)与丝氨酸乙酯盐酸盐(SER)的酰胺化反应制备了基于丝氨酸的含有双硫键的二醇单体—二硫二丝氨酸乙酯酰胺(SS-BSER)。然后利用赖氨酸乙酯二异氰酸酯(LDI)与 SS-BSER的聚加成反应制备基于α-氨基酸的还原可降解聚氨酯(AAPU(SS))。接着通过 AAPU(SS)二醇和PEG-NCO的氨酯反应制备三嵌段聚合物，聚乙二醇-b-聚氨酯-b-聚乙二醇(PEG-AAPU(SS)-PEG)用于药物传递系统。结果表明，该三嵌段聚合物可以在水中自组装形成尺寸大约为155 nm的胶束型纳米粒子(PEG-AAPU(SS)-PEG胶束)，并且可以包载疏水抗癌药物阿霉素(DOX)。细胞毒性试验表明，在胶束浓度在0.1到1.0 mg/mL时，RAW264.7和MCF-7/ADR细胞存活率均大于90％。体外释放实验表明载药胶束在含有10 mM谷胱甘肽(GSH)的PB（10 mM, pH7.4）中12 h释放了84%的阿霉素(DOX)，而在不含GSH的介质中12 h仅释放了29%。激光共聚焦照片显示载药胶束可以将DOX高效地运送到细胞内，并在细胞内快速释放出DOX。MTT结果表明，载DOX胶束对RAW264.7和MCF-7/ADR细胞均有明显的细胞毒性。特别是对耐药MCF-7/ADR细胞，体外毒性测试结果表明载药胶束的毒性比自由DOX高，当DOX的浓度为40μg/mL时，经载药胶束和自由DOX孵育48 h的细胞存活率分别为22.3%和57.9%。这种新型基于α-氨基酸的还原可降解的聚氨酯为可控药物传递系统的设计与合成提供了新的思路。
　　论文第三章在第二章合成的PEG-AAPU(SS)-PEG载体表面修饰了c(RGDfK)多肽，制备了人脑胶质瘤细胞靶向的载药胶束。该胶束由c(RGDfK)-PEG-AAPU(SS)-PEG-c(RGDfK)和PEG-AAPU(SS)-PEG两种聚合物组成。通过调节两种聚合物的比例，可制备得到表面 c(RGDfK)含量不同的胶束。载 DOX胶束的MTT数据表明，含有30 wt.%靶向分子的载药胶束的半致死浓度（IC50）为4.8μg/mL，是无靶向载药胶束的1/3，且较接近于自由DOX（IC50=3.3μg/mL）。流式细胞结果和激光共聚焦照片均显示，靶向30T-AAPU(SS)胶束与非靶向胶束相比，能快速进入 U87 MG细胞并释放 DOX，显示出更强的荧光。靶向内吞抑制实验说明了c(RGDfK)靶向的胶束纳米粒子可以通过受体介导内吞的方式迅速进入U87 MG细胞。通过表面偶联c(RGDfK)多肽，有效地增加了肿瘤细胞对这种基于氨基酸还原可降解聚氨酯胶束的内吞，提高了DOX的药效。
　　论文的第四章在第二章合成的AAPU(SS)基础上，通过侧链改性合成了主链含有双硫键，侧链含有组胺(Histamine)基团的聚氨酯，连接 PEG后得到了聚乙二醇-b-聚氨酯(-g-组胺)-b-聚乙二醇三嵌段聚合物(PEG-AAPU(SS)(-g-his)-PEG)，进而制备了还原与pH双重敏感的聚合物胶束用于DOX的高效细胞内释放，并研究了其内涵体逃逸性能。载DOX的20H-AAPU(SS)胶束在pH5.0醋酸钠缓冲液(其中含10 mM GSH)的条件下24 h内释放了接近100%的DOX。载DOX的20H-AAPU(SS)胶束相对于NH-AAPU(SS)胶束，对RAW264.7和MCF-7/ADR细胞表现出了更强的细胞毒性(使其IC50分别下降了5和2.7倍)。CLSM测试显示核内含有咪唑基团的聚合物载药胶束由于质子海绵效应能快速从内涵体逃离到细胞质还原环境中，表现出体外较高的抗癌活性。
　　第五章对本论文的工作进行了全面的总结，并对以后可能进行的工作进行了展望。

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第一章 文献综述

1.1 前言

1.2 肿瘤微环境响应性纳米载体

1.3 细胞内环境响应性纳米载体

1.4 双重或多重响应性纳米载体

1.5基于聚氨酯的刺激响应性纳米载体

1.6 课题的提出及研究内容

参考文献

第二章 基于氨基酸的具有还原响应的聚氨酯胶束用于抗癌药物阿霉素(DOX)的细胞内释放

2.1 引言

2.2 实验部分

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

参考文献

第三章 c(RGDfK)修饰的基于氨基酸还原可降解聚氨酯胶束用于阿霉素(DOX)的脑胶质瘤体外靶向释放

3.1 前言

3.2 实验部分

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

参考文献

第四章 侧链组胺修饰的基于氨基酸的具有pH和还原双重响应的聚氨酯胶束用于DOX的细胞内释放

4.1 前言

4.2 实验部分

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

参考文献

第五章 结论与展望

5.1 结论

5.2 研究展望

攻读硕士学位期间本人出版或公开发表的论著、论文

致谢