CYP酶抑制试验中低溶解度抑制剂IC50偏高问题的解决方案研究

摘要

目的:建立人肝微粒体体外CYP酶抑制模型，研究CYP酶抑制试验中低溶解度抑制剂IC50偏高问题的原因以及解决方案，提高CYP酶抑制试验中低溶解度抑制剂抑制率测定的准确度，减少新药研发过程中的风险和费用，避免药物相互作用对用药安全带来的影响。
　　方法:人肝微粒体与抑制剂(如CYP1A2:呋拉茶碱，CYP2C9:磺胺苯吡唑，2C19:(+)-N-3-Benzylnirvanol，2D6:奎尼丁，3A4:酮康唑等）预孵育后，加入特异性探针底物（如CYP1A2:非那西汀，CYP2C9:双氯芬酸，2C19:美芬妥英，2D6:右美沙芬，3A4:睾酮等）进行共孵育。应用LC-MS/MS法测定孵育液中五种特异性探针底物经过各自专属的CYP450酶转化后生成的代谢物浓度（如CYP1 A2:对乙酰氨基酚，CYP2C9:4-羟基双氯芬酸，2C19:4'-羟基美芬妥英，2D6:去甲右美沙芬，3A4:6β-羟基睾酮等），计算抑制剂对不同亚型的CYP酶的半抑制浓度(IC50)，以评价各个抑制剂对各亚型CYP酶的抑制能力。分别建立单浓度抑制剂和多浓度抑制剂的CYP酶抑制试验模型，并进行比较。建好模型后，选择不同溶解度的抑制剂，采用单因素分析法，通过分别改变抑制剂溶剂、人肝微粒体浓度、抑制剂浓度来观察抑制剂溶剂、肝微粒浓度和抑制剂浓度对半抑制浓度(IC50)测定的影响。单因素分析后，再同时改变抑制剂溶剂、人肝微粒体浓度、抑制剂浓度来分析同时改变这三个条件对半抑制浓度(IC50)测定的影响。
　　结果:(1)成功建立人肝微粒体体外CYP酶抑制模型。单浓度和多浓度抑制剂模型能得到高度接近的IC50值，其线性相关系数(R2)高达0.94，说明单浓度点的抑制模型与多浓度点的抑制模型所测得的IC50同样准确可靠。(2)在单因素比较试验中，选择不同溶解度的抑制剂:将常规溶剂从H2O换成DMSO时，溶解度较大的抑制剂如磺胺苯吡唑、红霉素和氟康唑对CYP2C9和CYP3A4的半抑制率(IC50)无显著性差异，而溶解度较小的抑制剂如索拉菲尼、非洛地平、特非那定和胺碘酮对CYP2C9和CYP3A4的IC50值具有显著性影响(P＜0.05)，将抑制剂溶剂从H2O变为DMSO可显著性降低低溶解度抑制剂的IC50值。
　　将人肝微粒浓度从0.5mg/ml降至0.05mg/ml时，溶解度较大的抑制剂如磺胺苯吡唑、氟康唑对CYP2C9、红霉素对CYP3A4对CYP2C9的IC50值均无显著性差异;氟康唑对CYP3A4的IC50值具有显著性差异(P＜0.05)。说明改变微粒体浓度对大溶解度抑制剂IC50值的影响表现不一。而溶解度较小的抑制剂如索拉菲尼、非洛地平、特非那定和胺碘酮对CYP2C9和CYP3A4的IC50值具有显著性影响(P＜0.05)，将人肝微粒体从0.5mg/ml降至0.05mg/ml可显著性降低低溶解度抑制剂的IC50值。
　　将抑制剂浓度从10μM降至3μM时，溶解度较大的抑制剂如磺胺苯吡唑、红霉素、氟康唑和酮康唑对CYP2C9和CYP3A4的IC50均无显著性差异（除了红霉素对CYP3A4的IC50虽具有显著性差异但无生物学差异）。而溶解度较小的抑制剂如特非那定和胺碘酮对CYP2C9的IC50值具有显著性差异(P＜0.05)，索拉菲尼和非洛地平对CYP2C9以及特非那定和胺碘酮对CYP3A4的IC50值虽无显著性差异，但有降低的趋势。说明改变CYP酶抑制模型中抑制剂浓度对低溶解度抑制剂的IC50测定具有影响，将抑制剂浓度从10μM降至3μM可降低低溶解度抑制剂的IC50值。
　　(3)选择不同溶解度的抑制剂，在抑制剂溶剂、微粒体浓度和抑制剂浓度综合考察试验中，优化前的方法与优化后的方法相比，所有溶解度的抑制剂对CYP2C9和CYP3A4的IC50值均具有高度显著性差异(P＜0.01)。但是溶解度大的化合物对CYP2C9和CYP3A4的IC50值差异在2～3倍左右;而溶解度小的化合物对CYP2C9和CYP3A4的IC50值差异有10多倍，具有更显著的生物学差异。说明同时改变抑制剂溶剂、微粒体浓度和抑制剂浓度对IC50的测定值有显著性影响。
　　结论:1.建立了人肝微粒体体外CYP酶抑制模型，单浓度和多浓度抑制剂模型能得到高度接近的IC50值，线性系数达0.94，单浓度抑制剂模型可以大大节约研究费用和提高测定效率。2.抑制剂溶剂、人肝微粒体浓度和抑制剂浓度对人肝微粒体体外CYP酶抑制模型中低溶解度抑制剂IC50值的测定具有显著影响，增加抑制剂溶剂中有机溶剂比例，降低人肝微粒体浓度，降低抑制剂浓度均可使低溶解度抑制剂IC50值有所降低，如果同时改变这三个因素将会得到更小更准确的IC50值，进而提高新药筛选的准确度和成功率。

目录

声明

摘要

引言

第一部分 人肝微粒体体外CYP450酶抑制模型的建立及单浓度与多浓度抑制剂模型的比较研究

1．人肝微粒体体外CYP450酶抑制模型(单浓度抑制剂)

1．1 材料

1．2 方法

1．3 结果

2．人肝微粒体体外CYP450酶抑制模型(多浓度抑制剂)

2．1 材料

2．2 方法

2．3 结果

3．讨论

第二部分 采用单因素分析法应用人肝微粒体体外CYP酶抑制模型分别研究抑制剂溶剂、微粒体浓度和抑制剂浓度对IC50测定值的影响

1．抑制剂溶剂对IC50测定值的影响

1．1 材料

1．2 方法

1．3 结果

2．微粒体浓度对IC50测定值的影响

2．1 材料

2．2 方法

2．3 结果

3．抑制剂浓度对IC50测定值的影响

3．1 材料

3．2 方法

3．3 结果

4．讨论

第三部分 应用人肝微粒体体外CYP酶抑制模型研究抑制剂溶剂、微粒体浓度和抑制剂浓度对IC50的影响

1．材料

2 方法

2．1．抑制剂、特异性探针底物和底物代谢物浓度

2．2 孵育方法

2．3 检测方法

2．4 数据处理方法

3 结果

4．讨论

结论

参考文献

综述：有机溶剂对CYP酶活性的影响

中英文缩写词表

研究生期间科研经历发表的文章

致谢