公共引物介导的多重PCR技术在细菌性脑膜炎诊断中的应用研究

摘要

本文主要从以下几方面进行了论述：
　　第一部分:一种高效筛选公共引物的方法
　　目的:设计一种筛选公共引物的方法。
　　方法:将3条正向引物和3条反向引物序列连接于一段人类β-actin基因序列两端，将连接片段导入pMD19-T载体构建重组质粒，利用此质粒模板进行9对引物的敏感性检测。步骤包括:引物设计、插入序列的选择、酶切转化、质粒提取、敏感性检测。
　　结果:区别9对公共引物的敏感性，筛选出灵敏性较高的公共引物对。
　　结论:该方法操作简单、高效和快速，可用于公共引物的高效筛选。
　　第二部分:筛选检测细菌性脑膜炎的公共引物
　　目的:筛选出一条适用于细菌性脑膜炎检测的多重PCR体系的公共引物。
　　方法:通过特异性比较，挑选出3条公共引物。运用高效筛选公共引物的方法，对3对公共引物进行敏感性检测。
　　结果:UP1、UP2和UP3的特异性均较高，但敏感性分别为102，106，103拷贝。
　　结论:本次实验筛选出的UP1可优先用于多重PCR体系的构建。
　　第三部分:细菌性脑膜炎多重PCR检测体系的设计与鉴定
　　目的:以导致细菌性脑膜炎的常见六种细菌为检测靶标，建立新型具有高通量的“公共引物”介导的多重PCR检测体系，研发适用于临床的细菌性脑膜炎的检测试剂盒。
　　方法:包括三部分:(1)质粒模板的构建:对目的模板和载体双酶切以后连接转化，重组质粒进行菌落PCR和测序鉴定;(2)多重体系的建立:设计特异性引物和嵌合引物;确定扩增体系和反应条件;体系特异性检测;体系敏感性检测;(3)临床标本的检测:提取CSF基因组DNA，用构建的UP-M-PCR体系进行检测。
　　结果:嵌合引物和UP-M-PCR体系扩增靶标序列时无非特异性带产生， S.agalactiae，L.monocytogenes, S.pneumoniae，N.meningitis,H.influenza和S.aureu的多重体系敏感性检测结果分别为102，103，10，102，102和104拷贝。运用UP-M-PCR体系进行临床标本的检测时，成功检出3例标本。
　　结论:本课题构建的UP-M-PCR检测体系具有较高的特异性和敏感性，可用于检测细菌性脑膜炎病原体的检测，具有临床应用价值。

目录

声明

摘要

研究背景

参考文献

第一部分 一种高效筛选公共引物的方法

材料和方法

实验结果

讨论

参考文献

第二部分 筛选检测细菌性脑膜炎的公共引物

材料和方法

实验结果

讨论

参考文献

第三部分 细菌性脑膜炎多重PCR检测体系的设计与鉴定

材料和方法

实验结果

讨论

参考文献

结论

综述 脑炎常见病原体分析及临床辅助检查方法

攻读学位期间发表的论文、科研成果

附录

致谢