TIMELESS在宫颈癌中的异常表达及靶向治疗的研究

摘要

目的：探索TIMELESS在宫颈癌中的表达及其功能，靶向TIMELESS对宫颈癌细胞增殖、凋亡、衰老、克隆、顺铂敏感性的影响。
　　方法：生物信息学分析 TIMELESS在三个独立的宫颈癌基因芯片数据库中的表达；通过对子宫颈上皮内瘤变（Cervical Intraepithelial Neoplasia，CIN）和宫颈癌组织进行免疫组化研究，分别检测TIMELESS在CIN I、CIN II、CIN III和宫颈癌组织中的表达；利用宫颈癌组织芯片进行免疫组化分析，研究 TIMELESS在宫颈癌组织中的阳性表达率；用Western Blot技术分析人宫颈癌细胞株HeLa、SiHa、Caski、C33A细胞中TIMELESS的表达，筛选高表达细胞株；设计合成三组针对人TIMELESS基因的小干扰RNA(siRNA)，并通过脂质体Lipofectamine2000将其转染至SiHa细胞株体内，应用 Western blot技术检测实验组（TIMELESS siRNA＃1组、siRNA#2组和siRNA#3组）及阴性对照 siRNA(Ctrl siRNA组)TIMELESS mRNA和蛋白的表达；CCK8法检测三组细胞的增殖能力以及对顺铂敏感性的变化；通过流式细胞检测技术检测各实验组在凋亡中的差异；细胞克隆形成实验检测三组细胞的克隆形成能力；细胞株转染TIMELESS siRNA并联合顺铂处理，β-半乳糖苷酶法检测各组细胞的衰老；通过Western blot技术检测凋亡蛋白Cleaved caspase-3各组细胞的表达；通过Western blot技术检测TIMELESS敲除后各组细胞γ-H2AX及Rad51蛋白的表达。
　　结果：1.基因芯片数据分析显示TIMELESS在宫颈癌组织中的表达水平明显高于正常宫颈组织（P<0.05）,提示 TIMELESS可能在宫颈癌进展中发挥重要作用；2.TIMELESS在从CIN I、CIN II、CIN III到宫颈癌的进展过程中阳性表达水平逐渐升高，呈明显递增趋势(P<0.05）；3.对宫颈癌的组织芯片进行TIMELESS免疫组化分析，发现 TIMELESS在宫颈癌中有52.5％(21/40例)呈阳性表达；4.宫颈癌细胞株HeLa、SiHa、Caski、C33A细胞中TIMELESS蛋白表达水平中，SiHa细胞中TIMELESS蛋白表达较高；5.靶向TIMELESS的三对特异性siRNA：siRNA#1,siRNA#2,siRNA#3均可明显抑制TIMELESS的表达，在SiHa细胞中，相对Ctrl siRNA组，RTPCR结果显示 siRNA#1、siRNA#2、siRNA#3组中 TIMELESS的 mRNA表达量分别为（0.263±0.018）、（0.157±0.013）、（0.286±0.021），Western Blot结果显示 siRNA#1、siRNA#2、siRNA#3组中TIMELESS蛋白表达量分别为（0.162±0.052）、（0.134±0.057），（0.173±0.062）（P<0.01）。siRNA#1和siRNA#2的效果较好。6.CCK8法检测细胞增殖实验显示siRNA#1组与siRNA#2组细胞的增殖能力显著下降；7.细胞凋亡实验显示实验组 siRNA#1组与 siRNA#2组的细胞早期凋亡明显增加;8.在 Ctrl siRNA、siRNA#1、siRNA#2三组实验细胞中，SiHa细胞克隆数为（209.333±3.383），（111±3.786），（129.667±3.590）；9.β-半乳糖苷酶法检测各组细胞的衰老，顺铂作用后，显示实验组的衰老细胞比率均上升（P<0.0001）。10.随着顺铂浓度的增加，Ctrl siRNA、siRNA#1、siRNA#2三组实验细胞的增殖均受到抑制，细胞半数抑制率IC50（μg/ml）分别为7.907，5.052，2.565，可见TIMELESS siRNA可以增加宫颈癌SiHa细胞株对顺铂的敏感性；11.实验组中，凋亡相关蛋白 Cleaved caspase-3表达有明显的增加；12. TIMELESS敲减后，DNA损伤相关蛋白γ-H2AX表达增加，同时可以抑制SiHa细胞中DNA损伤修复相关蛋白Rad51的表达。
　　结论：TIMELESS在宫颈癌中异常高表达，靶向敲减TIMELESS，可以抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖和克隆形成能力、促进SiHa凋亡和衰老，并增强SiHa细胞对顺铂化疗的敏感性。

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第一章引言

第二章材料和方法

1. 材料

2．方法

第三章结果

3.1TIMELESS在宫颈癌中高表达

3.2 TIMELSS在临床宫颈癌及癌前病变标本中的表达

3.3 TIMELESS在宫颈癌组织芯片中的表达

3.4 Western Blot检测人宫颈癌细胞株的TIMELESS的表达

3.5Real-Time PCR及Western Blot检测转染后48h后TIMELSS在细胞中的表达情况

3.6 CCK8法检测转染后细胞的增殖

3.7流式细胞仪检测TIMELESS siRNA对细胞凋亡的影响

3.8 细胞平板克隆实验检测TIMELESS siRNA转染SiHa细胞后的克隆形成能力

3.9β-半乳糖苷酶法检测TIMELESS siRNA转染后SiHa细胞的衰老

3.10 CCK8法检测各组细胞对顺铂化疗的敏感性

3.11 Western Blot 检测 TIMELESS siRNA 转染后 72 小时，凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase-3的表达

3.12用Western Blot检测TIMELESS siRNA转染后SiHa细胞中DNA损伤修复相关蛋白Rad51的表达

第四章讨论

结论

参考文献

综述;TIMELESS基因的研究进展

攻读学位期间公开发表的论文

中英文对照缩略词表

致谢