利用全外显子组深度测序技术筛选和验证膀胱移行细胞癌中的突变基因

摘要

目的：利用全外显子组深度测序技术发现和筛选膀胱移行细胞癌(Transitional Cell Carcinoma Of Bladder，TCCB)中的致病候选突变基因，然后，应用Sanger测序技术进行验证，为膀胱癌病因学研究提供一定的理论依据，并探寻理想的肿瘤诊断标志物和有效的治疗靶点。
　　方法：
　　第一部分，取苏州大学附属第一医院2012年4月手术治疗的4对膀胱移行细胞癌患者的癌及癌旁组织，其中2个病例为非肌层浸润性（非浸润组），2个病例为肌层浸润性（浸润组）。采用SOLID深度基因测序的方法进行全外显子组测序，并通过特定的筛选条件进行过滤，选出其中突变的候选致病基因。
　　第二部分，Sanger测序标本：一部分为苏州大学附属第一医院病理科提供的2011年9月至2013年5月膀胱移行细胞癌手术切除标本50例，其中浸润性26例，非浸润性24例；另一部分来自江苏省盐城市第一人民医院病理科提供的2010年3月至2012年12月膀胱移行细胞癌术后石蜡包埋切片组织49例，其中浸润性35例，非浸润性14例；另取10例癌旁组织作为对照。应用Sanger测序技术验证深度测序中的突变结果。然后，采用免疫组化Envision二步法检测制作的25例蜡块，观察HECW1（HECT，C2 and WW domain-containing protein1）蛋白在癌组织和癌旁组织中的表达差异。
　　结果：
　　第一部分：深度测序结果数据质量满意，测序长度为75bp，准确度＞99％，平均覆盖度51×，捕获效率62%，覆盖度5×以上达92%。经过筛选和过滤，发现众多突变基因，非浸润组候选基因有38个，浸润组有40个，非浸润组和浸润组共有的候选基因有20个；而非浸润组中插入和缺失（INDEL）有5个，浸润组有3个，两组共有的有1个。将在外显子上检测到的突变候选基因，经过文献检索和复习，挑选出有功能介绍和与肿瘤相关的基因，分别是：IVL、RGPD5和ZNF79位于非浸润组中；SRGAP2、FMN2、MUC6、CPNE7、MMP9、MAGEE1和TRO位于浸润组中；MUC4、HECW1和CTBP2是两组共有的。其中，RGPD5可能参与了RAS-MAPK信号通路；CTBP2和HECW1可能在Wnt信号通路中起作用；而HECW1和MAGEE1均参加了泛素蛋白酶体信号途径；MUC4能够与ERBB2结合成复合体，在ERBB2信号通路中有着重要的作用；FMN2、CPNE7和MMP9在细胞周期调节和P53信号通路中对凋亡有着重要的影响。
　　第二部分：将在外显子中检测到的13个经过文献检索和复习的有功能的基因再次行SNP和标准核苷酸BLAST比对，发现其中有6个非同义突变基因，分别是：IVL、RGPD5、CPNE7、ZNF97、HECW1和TCHH；5个同义突变基因，分别是：FMN2、MMP9、TRO、MAGEE1和MUC4。先选取非同义突变中4个基因（CPNE7、ZNF79、IVL、HECW1）应用Sanger测序验证，99例膀胱癌组织中仅有HECW1发现6例基因突变，比例为6.06%，均为点突变，位于第11号外显子，且与深度测序突变位点相同或在附近区域。其中，38例非浸润性膀胱癌组织DNA中，1例同义突变，比例为2.63%；61例浸润性膀胱癌组织DNA中，4例错义突变和1例无义突变（即突变为终止密码子），比例为8.20%，两者突变比例无统计学意义（P>0.05），对照组10例未发现突变。不同医院来源的标本中，盐城市一院标本发生突变的比例（8.10%）明显高于苏大附一院（4%），两者比较未发现有明显差异（P>0.05）。免疫组化中，15例肿瘤组织9例阳性，阳性率60.0%，10例对照组1例阳性，阳性率10%，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　结论：（1）全外显子组深度测序方法是发现膀胱肿瘤候选致病基因的有效手段。（2）Sanger测序是检验深度测序结果的金标准。（3）在膀胱移行细胞癌发生发展中HECW1基因可能是一个重要的致病基因。（4）HECW1蛋白在膀胱癌组织中的表达高于癌旁组织。

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前言

第一部分 应用全外显子组深度测序研究膀胱移行细胞癌的致病候选基因

引言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 Sanger测序对候选突变基因的验证及应用免疫组化研究HECW1蛋白水平的变化

引言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

小结

不足与展望

综述;二代测序技术在肿瘤生物学的应用进展

中英文对照缩略词表

攻读学位期间公开发表的论文

致谢