果糖-1,6-二磷酸酶在肝癌中的表达及其调控机制

摘要

目的：
　　检测果糖-1,6-二磷酸酶(FBP1)在肝癌中的表达，分析其与患者预后的关系。探讨组蛋白去乙酰化酶(HDAC)对FBP1缺失的调控机制，及FBP1对肝脏肿瘤细胞生物学行为的影响。
　　方法：
　　通过免疫组织化学染色法检测90例肝癌患者肿瘤组织及相应的癌旁组织中FBP1的表达。采用配对秩和检验比较肝癌组织与癌旁组织中 FBP1的表达水平，Kaplan-Meier法和Log-rank检验分析FBP1表达水平与患者生存期的关系。为进一步探讨肝癌中FBP1的调控机制采用HDAC抑制剂NaBu、SAHA、LBH按浓度梯度处理HepG2及SK-Hep1细胞，western blot及real-time PCR检测FBP1蛋白及mRNA水平的变化。利用siRNA转染实验敲除肝癌细胞株中HDAC1及HDAC2，并检测其对 FBP1表达的影响。染色质免疫共沉淀实验检测 HDAC与 FBP1的结合位点。90例临床组织标本同时经免疫组化检测 FBP1、HDAC1及 HDAC2，并分析其相关性。HepG2及SK-Hep1细胞经病毒感染，分别构建稳转pcDNA3.1，pLenti6.3/FBP1，NS shRNA，FBP1 shRNA的稳转细胞株。葡萄糖检测试剂盒检测转染后细胞对葡萄糖消耗的变化。MTS检测肝癌细胞株过表达FBP1对细胞增殖的影响。免疫缺陷小鼠荷瘤实验检测FBP1过表达对肿瘤增殖的影响。
　　结果：
　　FBP1在肝癌组织中的表达明显低于相应的癌旁组织，差异有统计学意义(Z=7.952，P＜0.001)。小肝癌中FBP1的表达水平高于非小肝癌(P=0.005)。AJCC分期越高，FBP1表达越低(P=0.001)。FBP1高表达组患者平均生存期为50.17个月，低表达组患者平均生存期为34.88个月，差异有统计学意义(P=0.034)。肝癌细胞株经HDAC抑制剂NaBu、SAHA、LBH处理后，FBP1蛋白及mRNA水平明显升高，并且具有药物浓度依赖性。单独干扰肝癌细胞株中HDAC1及HDAC2后可上调FBP1的蛋白及mRNA水平，共同敲除HDAC1及HDAC2后FBP1上调更显著。HDAC通过与FBP1增强子区AcH3K27位点结合，影响FBP1的转录。90例临床标本免疫组化检测结果也提示FBP1与HDAC1及HDAC2的表达均呈负相关(r=-0.64，P＜0.05；r=-0.61，P＜0.05)。恢复肝癌细胞中FBP1的表达，可减低肿瘤细胞对葡萄糖的消耗，抑制肿瘤细胞增殖，抑制肿瘤细胞在免疫缺陷小鼠皮下成瘤。
　　结论：
　　FBP1在肝癌中功能缺失，是判断患者预后的因素。HDAC1及HDAC2协同抑制FBP1增强子区H3K27位点的乙酰化，调控FBP1的表达。FBP1干扰肝脏肿瘤细胞糖酵解过程，降低葡萄糖消耗，减低肿瘤细胞供能，抑制肿瘤细胞增殖。

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引言

1瓦博格效应(Warburg effect)

2. 果糖-1,6-二磷酸酶(fructose 1,6-bisphosphatase, FBPase)

3. 表观遗传学

4. 组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)及组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor, HDACI)

5. 研究目标

参考文献

第一部分 果糖-1,6-二磷酸酶在肝癌中的表达及其与患者预后的关系

一 材料与方法

二 结 果

三 小 结

参考文献

第二部分 组蛋白去乙酰化作用影响FBP1表达的调控位点及调控机制

一 材料与方法

二 结 果

三 小 结

参考文献

第三部分 果糖-1,6-二磷酸酶对肝癌细胞生物学活性的影响

一 材料与方法

二 结 果

三 小 结

参考文献

讨论

展望

结论

综述: 果糖-1,6-二磷酸酶的研究进展

附录一肝癌临床资料

附录二 缩略词表

攻读博士期间发表的文章

致谢