MiR-106b在类风湿关节炎骨关节破坏中的作用及机制研究

摘要

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种累及关节的慢性炎症性自身免疫性疾病，主要表现为炎性细胞浸润、滑膜增生、关节软骨及骨质破坏。RA的发生机制尚不明确，目前多数学者认为T细胞介导的免疫调节的异常在RA的发生发展中起关键作用。MiR-106b是新近发现的一种 miRNA，既往研究证实其在肺癌、胃癌、肝癌和肾癌等组织中高表达，主要作为一种癌基因发挥作用；近年来miR-106b在炎症、骨改建以及免疫调节中的作用也逐渐引起重视。本研究在成功制备牛Ⅱ型胶原诱导的小鼠关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型基础上，研究调控miR-106b对小鼠CIA的治疗作用，并对其作用机制进行初步探讨。
　　目的：探讨靶向干预 miR-106b对 RA骨关节破坏的治疗作用，并进一步明确miR-106b调控RA发生的机理。
　　方法：雄性DBA/1小鼠40只，采用随机数字表法分成4组：对照组（Sham组），慢病毒载体组（NC组），miR-106b mimic组（Mimic组）和miR-106b inhibitor组(Inhibitor组)，每组10只小鼠。NC组，Mimic组和Inhibitor组在第二次免疫前1天（D20）分别经眼眶注射空慢病毒载体、miR-106b mimic和miR-106b inhibitor，剂量为200μl（1×108U/ml）；Sham组注射200μl生理盐水。观察小鼠的体重、足掌厚度，并对关节炎的肿胀程度进行评分（每三天1次）。D56处死小鼠，Micro-CT检查评估骨组织破坏程度，H&E染色评估滑膜增生和炎性细胞浸润程度，番红O染色检测软骨破坏程度，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色检测成熟破骨细胞，免疫组织化学染色检测肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、环氧化酶-2（Cyclooxygenase-2，COX-2）以及核因子-κB受体活化因子配体（receptor activators of nuclear factor- kappa B ligand，RANKL）和骨保护素（osteoprotegerin，OPG）的表达变化；RT-PCR检测CIA小鼠膝关节中miR-106b的表达变化；ELISA法检测外周血中抗Ⅱ型胶原（collagenⅡ，CⅡ）抗体，TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2、RANKL和OPG水平；流式细胞术检测脾脏中巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞以及T细胞亚群变化。
　　结果：NC和Mimic组小鼠D21开始，体重明显下降，与Sham组比较，差异有统计学意义；Inhibitor组在D35时升高小鼠体重，在D42时，小鼠体重明显恢复，与NC组比较，差异有统计学意义（p<0.05）。D21开始CIA小鼠足爪出现较明显的红肿并逐渐加重，Inhibitor组小鼠足爪红肿逐渐减轻，D49足掌厚度为（2.58±0.09)mm、关节炎评分为（10.2±0.98）与NC组[（3.06±0.07）mm，（13.8±1.65）比较，差异有统计学意义（p<0.05）。Micro-CT扫描结果显示NC和Mimic组有明显的骨质破坏，抑制miR-106b后骨质破坏明显减轻；Inhibitor组骨体积（BV）、骨体积分数（BV/TV）、骨面积分数（BS/BV）、骨小梁厚度（Tb.Th）分别为6.85±0.24 mm3、22.52±0.62％、9.46±2.02mm-1、0.31±0.06 mm，与NC组（5.61±0.35 mm3、16.26±1.42%、13.32±1.85 mm-1、0.24±0.06 mm）比较，差异有统计学意义（p<0.05）。H&E染色结果显示CIA小鼠关节腔可见大量炎症细胞浸润，滑膜增生明显；靶向阻断miR-106b后滑膜组织炎症明显减轻。番红O染色结果提示NC组和Mimic组软骨细胞大量坏死，局部软骨层几乎完全消失，Inhibitor组软骨细胞增多，软骨层结构较完整，软骨破坏评分（0.92±0.37）明显优于 NC组（2.5±0.51），差异有统计学意义（p<0.05）。TRAP染色结果显示CIA小鼠关节破坏局部有大片紫红色深染区域，Inhibitor组仅可见少量阳性染色区域，提示miR-106b inhibitor能够抑制破骨细胞活化。定量RT-PCR结果显示miR-106b在CIA小鼠膝关节中高表达，miR-106b inhibitor能明显降低miR-106b在小鼠膝关节中的表达，与NC组比较，差异有统计学意义（p<0.05）。免疫组织化学染色结果显示抑制miR-106b能减少TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2和RANKL的表达，增加 OPG的表达。血清中细胞因子检测结果显示，与 Sham组比较，CIA小鼠血清中抗CⅡ抗体水平明显升高，miR-106b inhibitor治疗后，抗CⅡ抗体含量降为（89.51±19.32ng/L），与NC组（118.53±11.32 ng/L）比较，差异有统计学意义（p<0.05）。CIA小鼠外周血中TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE2的含量明显增加，miR-106b inhibitor能抑制上述因子的表达。ELISA结果显示，miR-106b inhibitor能促进OPG的分泌，抑制RANKL的表达，使RANKL/OPG比值明显降低，与NC组比较差异有统计学意义（p<0.05）。流式细胞术结果显示CIA小鼠脾脏中CD11b+巨噬细胞、CD11c+树突状细胞和GR1+中性粒细胞比例显著增高；同时CD4+、CD28+、CD154+T细胞比例也明显增高，而CD8+T细胞比例减少，CD4+/CD8+比值上升。miR-106b inhibitor治疗组能显著降低脾脏中CD11b+、CD11c+、CD11c+以及CD4+、CD28+、CD154+T细胞比例，同时升高CD8+T细胞比例，恢复CD4+/CD8+比值。
　　结论：本实验研究显示抑制miR-106b的表达可以减轻CIA小鼠关节炎症和骨质破坏；抑制miR-106b能减少CIA小鼠脾脏中巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞的分布；抑制miR-106b能调节CIA小鼠脾脏中T细胞亚群的分布，恢复CD4+/CD8+比值。