S100A9过表达在急性髓细胞性白血病细胞株HL-60对化疗药物耐药作用中的研究

摘要

第一部分、S100A9慢病毒载体的构建以及慢病毒的包装
　　目的：构建S100A9慢病毒载体并包装慢病毒颗粒，为该基因在AML对化疗药物耐药作用中的研究奠定基础。
　　方法：以正常人BMMC cDNA为模板，克隆出S100A9全长cDNA并装载入pMD19-T载体中后，挑选出阳性克隆进行PCR、双酶切和测序鉴定。将测序正确的阳性克隆中的S100A9片段装载入目的载体pLVX-IRES-puro中，筛选阳性克隆后进行 PCR、双酶切及测序鉴定。利用磷酸钙沉淀法，将过表达载体与病毒包装质粒共同转染293T细胞，分别收集24h和48 h的病毒上清。收集转染后48h的293T细胞，western blot检测细胞中S100A9的蛋白表达。
　　结果：克隆出的S100A9片段与pMD19-T载体连接后的阳性克隆，经PCR和双酶切验证条带大小与目的条带大小几乎一致。挑选其中的五个克隆进行测序，结果显示插入片段的序列与NCBI数据库中S100A9的mRNA序列100％匹配。将测序正确的克隆中的片段插入目的载体pLVX-IRES-puro中，阳性菌落经PCR、双酶切和测序验证均与欲克隆的S100A9片段大小和序列100%匹配。收集转染后48h的293T细胞检测发现：与转染了空载体细胞中S100A9的蛋白含量相比，转染了过表达载体细胞中S100A9的蛋白表达量显著增加。
　　结论：成功构建S100A9慢病毒载体，并且包装出慢病毒颗粒。
　　第二部分、S100A9过表达可以引起急性髓细胞性白血病细胞株HL-60的选择性耐药
　　目的：研究S100A9过表达是否可以引起AML细胞株HL-60对临床常规化疗药物（柔红霉素、依托泊苷、阿糖胞苷以及高三尖杉酯碱）的耐药。
　　方法：利用慢病毒颗粒感染细胞并用嘌呤霉素药物筛选的方式，建立S100A9稳定过表达AML细胞株HL-60/S100A9，以及空载体HL-60/pLVX对照细胞株。四种临床常规化疗药物柔红霉素、依托泊苷、阿糖胞苷以及高三尖杉酯碱以依次递增的浓度分别处理这两组细胞24h后，使用CCK8检测细胞活性。对照细胞的四种化疗药物的IC50分别处理两组细胞24h后，使用凋亡试剂盒检测细胞凋亡。以IC25和IC50分别处理两组细胞后，使用western blot检测药物处理前后细胞中c-PARP的蛋白表达量。
　　结果:外源性S100A9整合进入HL-60细胞的基因组DNA中，同时HL-60/S100A9细胞中S100A9在mRNA和蛋白水平都显著增高。HL-60/S100A9细胞经过柔红霉素、依托泊苷和阿糖胞苷三种化疗药物处理后，细胞活性未受影响；但是高三尖杉酯碱显著抑制了细胞活性，与对照细胞相比没有统计学差异。柔红霉素、依托泊苷和阿糖胞苷药物处理两组细胞后，HL-60/S100A9组的凋亡细胞比率显著低于HL-60/pLVX组；然而高三尖杉酯碱处理后，两组凋亡细胞比例没有统计学差异。同样，HL-60/S100A9细胞中c-PARP蛋白在前三种药物处理后没有显著的改变；但是在高三尖杉酯碱处理后，蛋白表达呈现正向剂量依赖性。
　　结论：S100A9的高表达可以引起AML细胞株HL-60对临床常规化疗药物柔红霉素、依托泊苷和阿糖胞苷的显著耐药，从而预示AML疾病对治疗效果反应不良。S100A9过表达的AML细胞株HL-60对高三尖杉酯碱敏感。
　　第三部分、S100A9过表达急性髓细胞性白血病细胞株HL-60对Mcl-1抑制剂敏感
　　目的：进一步研究S100A9引起AML细胞株HL-60对临床常规化疗药物耐药的分子机制，并探索解决S100A9引发化疗药物耐药的途径。
　　方法:对HL-60/pLVX和HL-60/S100A9两组细胞分别进行RNA-Seq测序。对测序分析挑选出的候选基因进行蛋白水平的验证。使用Mcl-1小分子抑制剂YM-155处理细胞后，分别用MTT法检测细胞的活性以及western blot检测药物处理前后Mcl-1的蛋白表达。
　　结果：RNA-Seq结果显示，S100A9和Mcl-1的表达量在HL-60/S100A9中显著增高。以HL-60/pLVX为对照细胞，抗凋亡蛋白Mcl-1和Bcl-2在HL-60/S100A9中表达量显著增高。经过四种化疗药物（DNR、VP-16、Ara-C和HHT）处理后，Bcl-2的蛋白表达量在两组细胞中均未发生改变。经过 DNR、VP-16和Ara-C三种药物处理后，Mcl-1的蛋白表达量在两组细胞中也未发生改变；然而经过HHT处理后，Mcl-1的表达量在两组细胞中均显著降低。Mcl-1小分子抑制剂YM-155分别处理两组细胞后，细胞活性均受到抑制。并且，Mcl-1的蛋白表达量在两组细胞中也随着药物处理浓度的增加而显著降低。
　　结论：S100A9过表达可以引起抗凋亡蛋白Mcl-1的表达量显著上调；并且使用Mcl-1抑制剂YM-155有望克服S100A9过表达引起的AML细胞株HL-60对化疗药物耐药性。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

第一部分 S100A9慢病毒载体的构建以及慢病毒的包装

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 S100A9过表达可以引起急性髓细胞性白血病细胞株HL-60的选择性耐药

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 S100A9过表达急性髓细胞性白血病细胞株HL-60对Mcl-1抑制剂敏感

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述;S100A9作为药物靶点在肿瘤疾病中的研究

英汉双解缩列词表

攻读学位期间发表的论文

致谢