第一部分高糖通过増加G6PD的泛素化降解降低足细胞内G6PD的表达 目的：观察高糖高脂对足细胞增殖、凋亡、细胞骨架以及氧化还原的影响，过表达G6PD能否改善，以及研宄G6PD泛素化修饰的情况。 方法：检测高糖高脂培养下足细胞体内cleaved caspase-3的表达；检测高糖培养下足细胞体内NADPH、GSH/GSSG、细胞内R O S聚集情况；利用MTT方法检测高糖培养对足细胞的增殖的影响；利用鬼笔环肽荧光染色的方法检测高脂培养下足细胞F-actin排列的情况；利用质粒构建技术构建pCDNA3.0-Flag-G6PD质粒。足细胞按照实验目的分组，正常葡萄糖（N G，5.6mmol/L)、高浓度葡萄糖（H G，25mmol/L)、高浓度葡萄糖同时加过表达G6 P D腺病毒（HG/Ad2)及高浓度葡萄糖同时加空载腺病毒（HG/Laz); BSA对照、500pmol/L棕榈酸、500pmol/L棕榈酸加G6PD腺病毒、500^mol/L棕榈酸加空载腺病毒。HEK293T细胞按照实验目的分组：His-Ub质粒转染组;His-Ub和Flag-G6PD质粒共转染组;His-Ub质粒转染+MG132(20uM)组;His-Ub和Flag-G6PD质粒共转染+MG132(20uM)组。质粒转染48小时之后，R IP A裂解液裂解细胞，用Anti-Flag beads富集细胞裂解液中Flag-G6PD的蛋白，用H is的抗体进行G6PD泛素化的检测。Input样品利用Westernblot方法及抗体检测相应的蛋白。 结果：1、下糖下脂引起的足细胞的调亡，能够被过表达的G6PD所改善。 2、高脂培养能够使足细胞的F-actin骨架紊乱和氧化还原的失衡，G6 P D过表达则能够逆转这一现象。 3、通过质粒构建技术，成功构建pCDNA3.0-Flag-G6PD质粒。 4、与其他组相比，His-Ub和 Flag-G6PD质粒共转染+MG132组能够显著增加G6PD的泛素化修饰。 结论：过表达G6PD可以部分逆转高糖高脂对足细胞增殖、凋亡、形态和氧化还原的影响以及高糖通过泛素蛋白酶体途径降低足细胞内G6PD的表达。 第二部分V H L参与G6PD泛素蛋白酶体途径的降解 目的：查找并验证介导G6PD泛素化降解的E3酶。 方法：利用质粒构建技术，构建质粒pCDNA3.0-HA-VHL。利用酵母双杂交技术成功的筛选参与G6 P D的泛素化的E3酶。免疫共沉淀实验,HEK293T细胞按照实验目的分为2个组：H A-V H L质粒转染组、：Flag-G6PD和 H A-V H L质粒共转染组。两组在转染的最后6小时均加入MG132(20uM)，Co-IP裂解液裂解细胞，用Anti-Flag beads富集细胞裂解液中：Flag-G6PD的蛋白，用 H A的抗体检测H A-V H L蛋白。体内泛素化实验，HEK293T细胞按照实验目的分为3组：His-Ub质粒转染组；Flag-G6PD和His-Ub质粒共转染组；Flag-G6PD、His-Ub和 HA-VHL质粒共转染组。在转染的最后6小时均加入MG132(20uM)，R IP A裂解液裂解细胞，用 Anti-Flag beads富集细胞裂解液中Flag-G6PD的蛋白，用 H is的抗体进行G6PD泛素化的检测。Input样品利用Westernblot方法及抗体检测相应的蛋白。 结果：1、利用质粒构建技术，成功构建质粒pCDNA3.0-HA-VHL。 2、利用酵母双杂交实验筛选出与G6 P D相互作用的E3酶-VHL(Von Hippel-Lindau tumor suppressor)。 3、利用免疫共沉淀（Co-IP)方法，证明了 G6PD和 V H L的体内结合。 4、体内泛素化实验证明V H L能够增加细胞内泛素化的G6PD蛋白。 结论：V H L是参与G6PD泛素化降解的E3泛素连接酶。
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